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Development of a CRISPR/Cas9 genomeediting toolbox for Corynebacterium glutamicum

本文由中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所孫際賓課題組于2017年11月17日發(fā)表在Microb Cell Fact。

谷氨酸棒狀桿菌是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌，可用于生產(chǎn)各類(lèi)氨基酸及天然/非天然產(chǎn)物。作者開(kāi)發(fā)的CRISPR/Cas9 基因編輯工具基于Cas9和gRNA表達盒重構，Cas9和gRNA質(zhì)粒共轉化方法不僅克服了Cas9毒性還促使gRNA有效終止。本技術(shù)的基因敲除和基因插入效率分別達到60.0%和62.5%，另外開(kāi)發(fā)的CRISPRCas9介導的ssDNA 重組能夠精準的引入和點(diǎn)突變，效率超過(guò)80%。此方法也可對谷氨酸棒狀桿菌進(jìn)行雙位點(diǎn)有效編輯。

文章脈絡(luò )

1、優(yōu)化Cas9 和gRNA的表達：用嚴格調控的Ptac啟動(dòng)子誘導調控Cas蛋白表達，組成型啟動(dòng)子P11F調控gRNA，TrrnB終止轉錄。

2、基因敲除與插入：以SL4（ATCC13869 衍生菌株，電轉效率高）為出發(fā)菌，先電轉pCas9質(zhì)粒，再電轉攜帶模板的pgRNA質(zhì)粒，ldhA基因缺失陽(yáng)性率8%，分析原因發(fā)現假陽(yáng)性菌cas9基因或被刪除，或無(wú)義突變失活，或者轉座酶插入失活。本文作者開(kāi)發(fā)的兩質(zhì)粒共轉化方法，可減少pCas9的復制，Cas9突變減少，細胞陽(yáng)性突變率達到47.3± 11.9%，基因插入效率25.0±8.3%。

3、CRISPR/Cas9和RecT介導ssDNA定向重組：按圖1流程，六個(gè)堿基插入編輯效率86.7±5.8%，三堿基突變編輯效率70%。

圖1：CRISPR/Cas9和RecT介導的ssDNA定向重組SL4ΔldhA:: rfp

4、質(zhì)粒消除：連續兩次無(wú)抗消除質(zhì)粒，消除效率約25.0%。

5、普適性：降低IPTG誘導濃度后，此編輯工具同樣適用于野生菌株ATCC13969和ATCC 13032，基因缺失/插入編輯效率如下表1。另外，此編輯工具點(diǎn)突變效率90.0%，雙位點(diǎn)點(diǎn)突變效率40.0%。

表1：在谷氨酸棒狀桿菌中CRISPR/Cas9介導的基因缺失和插入

DOI：10.1186/s12934-017-0815-5

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