這是一篇針對實(shí)驗室萌新寫(xiě)的關(guān)于CRISPR-Cas9技術(shù)的詳細介紹，對于實(shí)驗室老手也建議收藏轉發(fā)給師弟師妹，這樣省心省力，又能節省大量講解時(shí)間，這不香么？
原核生物的“免疫系統”
人體有著(zhù)一套復雜且高效的免疫系統，時(shí)刻保護著(zhù)我們免受病毒和細菌的攻擊。但是，對于弱小又無(wú)助的原核細胞而言，它們也是急切需要被保護的。為此，經(jīng)過(guò)幾億年的進(jìn)化，細菌和大部分古細菌衍生出了CRISPR-Cas系統，用于保護它們免受外源DNA和噬菌體的侵染。到目前為止，科學(xué)家們發(fā)現50%的細菌和超過(guò)90%的古細菌均攜帶有CRISPR-Cas系統。CRISPR是一段高度重復的DNA序列，兩端重復序列之間存在著(zhù)各不相同的spacer序列，表達Cas蛋白家族的基因簇位于CRISPR位點(diǎn)的上游，其表達翻譯的幾種類(lèi)型的Cas蛋白作為原核生物免疫應答的效應器發(fā)揮著(zhù)重要作用。
當細菌受到噬菌體的侵染時(shí)，被釋放到細菌細胞質(zhì)中的噬菌體基因組的某段DNA序列被識別并整合到CRISPR的spacer區域，隨后轉錄出相應的crRNA前體（pre-crRNA）。crRNA前體經(jīng)過(guò)修飾和加工，生成向導RNA（guide-RNA）。由于gRNA中存在一段來(lái)源于噬菌體基因組的序列，因此gRNA可以通過(guò)堿基的互補配對原則識別噬菌體的基因組。同時(shí)存在于細胞質(zhì)中的gRNA和Cas蛋白特異性結合，并靶向到噬菌體基因組參與DNA的切割與降解。
CRISPR-Cas9技術(shù)
簡(jiǎn)單來(lái)講，CRISPR-Cas9是一種分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)這種技術(shù)科研人員可以對細胞和生物體內的基因進(jìn)行編輯。所謂的基因編輯就是通過(guò)某種生物手段和技術(shù)，對生物體內的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修改。
基于原核生物的獲得性免疫系統研發(fā)出的CRISPR-Cas9技術(shù)只包含兩種重要的成分，一種是行使DNA雙鏈切割功能的Cas9蛋白，而另一種則是具有導向功能的sgRNA（single guide RNA）。當細胞內同時(shí)表達sgRNA和Cas9蛋白時(shí)，Cas9蛋白通過(guò)與sgRNA結合，靶向到目的DNA序列上發(fā)揮DNA雙鏈切割的功能。DNA序列被切割產(chǎn)生斷裂后，引發(fā)細胞內部的DNA修復機制（DNA repair）。真核細胞同時(shí)存在著(zhù)同源重組修復和非同源重組修復。在同源重組修復下，斷裂的染色體以另一條完整的姐妹染色單體為模板進(jìn)行DNA修復，而在非同源重組修復下，斷裂出的DNA隨機修復，引入新的堿基，使基因產(chǎn)生移碼突變。
基于CRISPR-Cas9的基因敲除
CRISPR-Cas9其中一種最為重要且廣泛的應用便是基因敲除。
那么，基因敲除又是什么呢？
從很久以前，生物學(xué)家們就熱衷于一種研究策略，那就是功能缺失策略（loss of function）。常規的理解是這樣的，當我們想要去研究某個(gè)基因在整個(gè)基因組中的作用時(shí)，只需要通過(guò)某種方法將這個(gè)基因從基因組中剔除，然后觀(guān)察去除這個(gè)基因之后，這個(gè)細胞或生物體會(huì )發(fā)生怎樣的變化，然后根據這些變化去推斷這個(gè)基因的功能?；蚯贸褪怯脕?lái)描述將某個(gè)或某些基因從基因組中剔除這件事，而基因敲除技術(shù)則是用于完成這件事的方法或技術(shù)。
那又該如何實(shí)現基因敲除呢？
在實(shí)際實(shí)驗過(guò)程中，我們只需要將Cas9蛋白和設計好的gRNA同時(shí)“運送”進(jìn)細胞中即可，接下來(lái)的就交給細胞自己去操作了。
那么，對于轉導gRNA和Cas蛋白的常見(jiàn)方法主要有四種：
1）RNP法。直接將大量的gRNA和Cas9蛋白，通過(guò)電轉的方式轉染目的細胞
2）病毒法。構建慢病毒（LV）敲除質(zhì)粒，經(jīng)病毒包裝和純化后轉染細胞，將sgRNA和Cas9蛋白元件整合到細胞基因組中，從而使細胞源源不斷地生產(chǎn)sgRNA和Cas9蛋白。
3）常規質(zhì)粒法。構建常規敲除質(zhì)粒，通過(guò)電轉將其導入細胞，短時(shí)間內表達gRNA和Cas9蛋白。
4）轉座子法（PiggyBac）。將攜帶有PB轉座子和piggyBac轉座酶(PBase)的質(zhì)粒共轉染細胞，轉座酶促進(jìn)轉座，將高拷貝的Cas9蛋白和gRNA表達元件隨機整合到基因組，實(shí)現gRNA和Cas9蛋白的持續表達。
這四種方法各有優(yōu)劣，我們在選擇時(shí)可根據所研究的靶基因及靶細胞的特性，選取適合自己研究要求的方法。這期的分享就到此為止，相信看到這大家對CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)有了不錯的理解。
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