十年前，當研究人員開(kāi)始解析細菌和古細菌中一個(gè)稱(chēng)為 CRISPR 結構的時(shí)候，他們并沒(méi)有預料到這會(huì )給基因編輯世界帶來(lái)一場(chǎng)風(fēng)暴。在過(guò)去的這一年半時(shí)間里，CRISPR 方法已迅速席卷了整個(gè)動(dòng)物王國，成為 DNA 突變和編輯的一種“馬上”技術(shù)——迄今為止在幾乎每種實(shí)驗細胞類(lèi)型中都能起作用，包括人類(lèi)細胞，小鼠，斑馬魚(yú)和果蠅細胞；這種技術(shù)也易于操作，已經(jīng)有兩個(gè)研究組利用 CRISPR 分析了人類(lèi)細胞中幾乎每個(gè)基因單突變（詳細報道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：張峰建立CRISPR/Cas9人細胞敲除體系）。就在最近，CRISPR 還幫助研究人員完成了攜帶特殊基因中斷（gene disruptions）的工程猴，這項壯舉此前曾在小鼠中實(shí)現過(guò)，但未在靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物中完成過(guò)（詳細報道 Cell：中國科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)構建基因工程猴）。
CRISPR 本身是一種防御系統，用以保護細菌和古細菌細胞不受病毒的侵害。在這些生物基因組中的 CRISPR 位點(diǎn)能表達與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子 RNA。當微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA 就能通過(guò)互補序列結合病毒基因組，并表達 CRISPR 相關(guān)酶，也就是 Cas，這些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。
將 CRISPR/Cas 系統用于其它非細菌細胞需要滿(mǎn)足兩個(gè)條件：一個(gè) Cas 酶，用于切斷靶標 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一個(gè)就是稱(chēng)為導向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，這種分子能通過(guò)互補結合靶標。gRNA 也就是細菌細胞中 CRISPR RNA 的一個(gè)更短的版本，它能與 Cas 形成復合物，指導 Cas 到達正確的剪切位點(diǎn)。不過(guò)研究人員也可以通過(guò)結合其它元件，或者改變 Cas 活性，來(lái)調整這種工具在基因校正和基因調控方面的作用。
“目前，非傳統基因編輯應用方面的生物學(xué)家利用一種新工具，分析細胞中，和整個(gè)生物機體中突變的作用”，來(lái)自加州大學(xué)伯克利分校的生物化學(xué)教授Jennifer Doudna 表示，她與她的同事解析了細菌細胞中 CRISPR 的作用機制。近期，Doudna 研究組利用這種工具，首次通過(guò)小鼠受精卵基因編輯構建了敲除小鼠。
不過(guò) CRISPR 技術(shù)也存在一個(gè)主要的缺點(diǎn)，那就是缺乏特異性：一些 gRNA 分子結合的 DNA 只是部分與 gRNA 互補。在這一方面，其它基因編輯方法，如鋅指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更為具有優(yōu)勢，因為這兩者需要識別更長(cháng)的靶標 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和細胞表達方面要比 gRNAs 難得多，而且研究人員通常還需要驗證十幾個(gè)不同的 TALENS，以及幾十個(gè)不同的 ZFNs，來(lái)證明其中一個(gè)有效。
近期《科學(xué)家》（The Scientist）雜志匯總了基因編輯過(guò)程中 Cas 和 gRNA 的處理過(guò)程及解決方案，用于幫助新接觸這一技術(shù)的研究人員熟悉這項熱門(mén)技術(shù)。
如何 CRISPR 我的靶標？
由于 CRISPR 系統并不復雜，因此我們所要做的就是將帶有質(zhì)粒（能表達 Cas 和 gRNA）的細胞進(jìn)行轉染。研究人員可以采用一種 Cas 的變體，即 Cas9，這種酶來(lái)自于一種鏈球菌，由 RNA 進(jìn)行指引，能無(wú)需其他蛋白的幫助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切斷與 gRNA 結合的 DNA 鏈，也能切斷其互補鏈。目前可以從 Addgene 購買(mǎi) Cas9 質(zhì)粒（65 美元），將其直接轉染入細胞。
gRNA 的長(cháng)度約為 80 個(gè)核苷酸，包含兩個(gè)區域： gRNA 5' 端前 20 個(gè)核苷酸對應于靶標 DNA，能結合在靶標 DNA 上，剩余的約 60 個(gè)核苷酸（gRNA 長(cháng)度取決于表達 gRNA 的質(zhì)粒）形成一個(gè)發(fā)夾結構，這個(gè)結構能幫助 gRNA 與 Cas9 結合，并由此指導與 DNA 的結合。
gRNA 與 Cas9 一樣，也是通過(guò)質(zhì)粒表達的，從 Addgene 可以購買(mǎi)幾種這種質(zhì)粒（65 美元），但是與 Cas9 不同的是，我們需要自己定制與靶標相匹配的表達質(zhì)粒。我們可以設計一個(gè)編碼 20 個(gè)堿基，與靶標 DNA 結合的片段，將其克隆進(jìn)表達質(zhì)粒里（編碼 gRNA 其它部分的60個(gè)核苷酸已經(jīng)在質(zhì)粒中了）。唯一的設計要求就是，gRNA 上要有一個(gè)片段，能與由任意核苷酸序列（N）+5' 末端兩個(gè)胞嘧啶核苷酸（-NCC）的 DNA 結合。這是因為 gRNAs 似乎與相對鏈包含兩個(gè)鳥(niǎo)嘌呤殘基（-NGG）的 DNA 片段結合最好，這種-NGG序列也就是 PAM 結構（protospacer adjacent motif）。
要在靶標 DNA 區域中挑選合適的 20 個(gè)堿基對，有幾個(gè)方案可以選擇，比如麻省理工學(xué)院的 CRISPR Design（crispr.mit.edu）；德國癌癥研究中心開(kāi)發(fā)的E-Crisp （www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr）；還有 ZiFiTtargeter（zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu）。另外也可以篩選整個(gè)基因組，找到與你的靶標位點(diǎn)相似的其它位點(diǎn)。
其中只有 CRISPR Design 和 E-Crisp 可以預測哪些 gRNA 序列特異性最強，ZiFiT 不具有這種功能。但是由于這些預測位點(diǎn)周邊的不確定性，研究人員仍然無(wú)法確保 gRNA 的嚴格特異性，因此專(zhuān)家們通常建議檢測至少 3-5 個(gè)不同的 gRNA。這些序列可以通過(guò)例如 Sigma Aldrich 公司，或者 Integrated DNA Technologies 公司合成，每個(gè)費用大約為 10-20 美元。
雖然 Cas9 和 gRNA 能通過(guò)各自的質(zhì)粒來(lái)表達，但是研究人員也可以選擇在同一個(gè)質(zhì)粒中表達 gRNA 和 Cas9，這對于難轉染的細胞來(lái)說(shuō)比較合適，比如免疫細胞。Addgene 公司也提供這種雙表達質(zhì)粒（價(jià)格為 65 美元）。不過(guò)為了快速地測試不同的gRNAs，研究人員可以利用 PCR 構建編碼 gRNA 的 DNA 片段，其中包含激活表達的啟動(dòng)子，然后將這個(gè)片段與攜帶 Cas9 的質(zhì)粒一同轉染細胞。這種方法無(wú)需克隆 gRNA 表達質(zhì)粒，可以節約兩天時(shí)間，來(lái)自Broad研究院的張鋒表示。
一旦你已經(jīng)在細胞中表達了 gRNA 和 Cas9 酶，那么這一復合物就能完成余下的工作，輕而易舉地切斷靶標 DNA 的兩條鏈。盡管細胞的 DNA 修復機制會(huì )試圖修補片段，但是由于存在一個(gè)稱(chēng)為非同源末端連接（nonhomologous end joining）的過(guò)程，因此往往最終會(huì )刪除或添加一個(gè)或兩個(gè)核苷酸，造成移碼突變，阻止基因表達。這樣通過(guò)靶向基因起始位點(diǎn)的周?chē)鷧^域，研究人員就能阻斷幾乎所有的表達。
如何檢測基因編輯的效率？
雖然 Cas9-gRNA 復合物作用強大，但是我們可能仍然希望能直接檢測下這一工具是否正確突變了靶標，或者有沒(méi)有出現脫靶的現象。這種方法與 ZFN 、TALEN不同——后兩者通常需要檢測許多融合蛋白，從中找到編輯靶標位點(diǎn)的那一個(gè)，CRISPR 方法則往往是利用嘗試的第一個(gè) gRNA 突變靶標，正如來(lái)自麻省總醫院的病理學(xué)家 Keith Joung 說(shuō)的那樣，他的實(shí)驗室檢測的約 90% 的 gRNAs 都完成了目的靶標的突變。
然而，Cas9-gRNA 在避免脫靶方面并不是那么可靠，去年發(fā)表的少數研究表明，一些 gRNAs 出現了多達 5 次錯配的脫靶問(wèn)題。不過(guò)還有一些研究表明 gRNAs 的特異性也很強，未曾出現過(guò)一次脫靶。Joung 表示，雖然沒(méi)有又快又好的方法來(lái)提高特異性，但我們可以挑選與潛在可能脫靶區域相似性最小的 gRNAs，來(lái)進(jìn)行這項研究，CRISPR Design等程序可以實(shí)現這一點(diǎn)。
Cas9-gRNA 工具常用于失活許多細胞中的一個(gè)興趣基因。研究人員可以通過(guò)證明這個(gè)基因產(chǎn)物無(wú)法表達，或者由于基因產(chǎn)物缺失而出現的某種細胞表型，來(lái)驗證這個(gè)工具的作用。為了確保這些作用不是由于突變了脫靶位點(diǎn)造成的，我們可以利用一種 Surveyor assay 來(lái)直接分析 DNA 靶標位點(diǎn)，預測脫靶位點(diǎn)。這需要通過(guò) PCR，以及一種特殊的酶（只切割帶有突變的 PCR 產(chǎn)物）放大靶標位點(diǎn)，然后再將突變和未突變的 DNA 片段在瓊脂糖凝膠中分離開(kāi)來(lái)，突變的片段會(huì )小一些，因為它們被切斷過(guò)。
這種方法也可以用于構建具有所有興趣基因相同突變的克隆細胞系，或者來(lái)自敲除小鼠的小鼠細胞，為了完成這些任務(wù)，我們可能需要確保 Cas9-gRNA 復合物沒(méi)有在未預測位點(diǎn)上引入一個(gè)突變。對于這些實(shí)驗我們可能還需要進(jìn)行整個(gè)基因組的高通量測序。
如何優(yōu)化 gRNA 的特異性？
除了挑選與非靶標位點(diǎn)互補性最小的 gRNA 序列以外，還有兩種可以減少脫靶效應的方法。
一個(gè)是轉染的 Cas9 和 gRNA 表達質(zhì)粒（或者 gRNA PCR 盒）數量盡可能的少，只要滿(mǎn)足所必需的靶活性的最低量就行。因為這些濃度足以令靶標位點(diǎn)突變，就不會(huì )去突變非特異性位點(diǎn)，——脫靶活性通常比靶向活性要低。
另一種策略是采用 Cas9 的另外一種突變版本： Cas9 nickase，這種酶只會(huì )切割結合 gRNA 的那條 DNA 單鏈。正常的 Cas9 切割的是雙鏈，單鏈缺口通常細胞會(huì )修補，但是如果細胞中表達的是 Cas9 nickase，以及與同一 DNA 靶標結合的一對 gRNAs，那么缺口上就能會(huì )出現突變。這種方法可以降低脫靶活性，因為不太可能兩個(gè) gRNAs 同時(shí)恰巧靠近脫靶位點(diǎn)。不過(guò)這種方法打靶效率可能會(huì )比正常 Cas9 和單個(gè) gRNA 低。
要想消除所有的脫靶效應是不可能的，因為其中許多可能出現在基因組中的任何非編碼區域。不過(guò)我們可以認為靶基因失活能引起可見(jiàn)的細胞效應，如果幾個(gè)結合不同基因區域的 gRNAs 出現了相同的表型，那么就能假定具有不同的脫靶效應，Joung 說(shuō)。通過(guò)表達質(zhì)粒將基因引入細胞，恢復失活基因的表型也是一種不錯的驗證方法。
利用 Cas9-gRNA 系統還能做什么？
過(guò)去一年半的研究表明，Cas9-gRNA 系統可以用于多個(gè)方面，比如張鋒實(shí)驗室就利用這一系統，在細胞中同時(shí)表達了，來(lái)自不同表達質(zhì)粒的5個(gè)靶向不同基因的 gRNAs，以及來(lái)自一個(gè)獨立表達質(zhì)粒的 Cas9，切割所有靶標位點(diǎn)?！鞍邢虺^(guò)5個(gè)基因也是可能的”，張鋒說(shuō)。而要想利用 ZFN 和 TALENS 系統做到這一點(diǎn)，是不可想象的，因為靶向單獨一個(gè)位點(diǎn)都要花費大量的人力物力。
除了失活基因，利用 Cas9-gRNA 還可以糾正基因。來(lái)自佐治亞理工學(xué)院的生物醫學(xué)工程叫聲包鋼（Gang Bao，音譯）正在朝著(zhù)這方面努力，他嘗試糾正一個(gè)破壞性的單核苷酸突變，患有鐮刀狀細胞貧血癥的患者其 β-珠蛋白基因上的兩個(gè)拷貝就出現了這種突變。研究人員利用 Cas9 nickase 和一對 gRNA 造成雙缺口，同時(shí)將一個(gè)線(xiàn)性 DNA 片段轉染進(jìn)細胞中，片段大小通常為 400-800 堿基，也可以是能作為基因糾正模板的小質(zhì)粒。
另外一個(gè)方面就是利用 Cas9 突變，這個(gè)突變并沒(méi)有完全切割 DNA，而是與能開(kāi)啟或關(guān)閉基因表達的蛋白結構域融合。gRNA 可以指導這個(gè)修改后的 Cas9 到達正確的遺傳元件，比如啟動(dòng)子和增強子，激活或抑制表達。這種用于基因抑制的方法被稱(chēng)為 CRISPRi，CRISPRi 已被證明比 RNAi（RNA 干擾）更為有效。
注：本文標注的費用均為美國當地價(jià)格，僅供參考。
