生物信息學(xué)應用：序列分析，電子克隆等初探
生物信息學(xué)可指利用信息技術(shù)管理和分析生物學(xué)數據。這就意味著(zhù)生物信息學(xué)所涉及的范圍相當廣泛，從人工智能、機器人一直到基因組(genome)分析。就基因組分析這一角度來(lái)看，生物信息學(xué)主要是指核酸和蛋白質(zhì)序列數據的計算機處理和分析。近年來(lái)，蛋白質(zhì)結構數據的快速增長(cháng)，使蛋白質(zhì)三維結構的處理分析也歸入到生物信息學(xué)的范疇。
近年來(lái)，三大國際一級生物信息數據庫，即美國國家信息中心 (National Center of Biotechnology Information, NCBI)的Gen Bank(http:/ / www. nchi. nlm. nih. gov/ web/Gen Bank/ imdex. html)、歐洲分子生物學(xué)室驗室(European Molecular Biology L aboratory-Euro-pean Bioinformatics Institute, EMBL-EBI)的 EM-BL (http:// ebi. ac.uk/ databases/ index.html)和日本 DNA數據庫 (DNA Data Bank of Japan, DDBJ) (http:/ / ddbj.nig.ac.jp/ )新收錄的核酸序列數據中，EST占65%以上[18]。隨著(zhù)生物信息學(xué) (Bioinformatics)的發(fā)展，通過(guò)檢索數據庫進(jìn)行核酸序列同源性檢索，電子基因定位、電子延伸、電子克隆和電子表達以及蛋白質(zhì)功能分析、基因鑒定等方面起到了重要作用，已成為人們認識生物個(gè)體生長(cháng)發(fā)育、繁殖分化、遺傳變異、疾病發(fā)生、衰老死亡等生命過(guò)程的有力工具。
1核酸序列的同源性檢索
目前，通過(guò)數據庫查詢(xún)、cDNA文庫直接測序、mRNA差別顯示 (DDRT-PCR)、代表性差示分析(RDA-PCR)和抑制差減雜交(SSH)等方法獲得的EST數據越來(lái)越龐大。GenBank數據庫中收錄的EST序列有數百萬(wàn)個(gè)之多。由于 EST代表著(zhù)一段表達基因序列，這樣就可用其與公共數據庫進(jìn)行同源性檢索，檢索與其同源的核酸序列。典型分析是采取NCBI的Blast軟件對GenBank 中的非冗余數據庫（non-redundant database,nr）進(jìn)行查詢(xún)。該數據庫是對GenBank EMBL 和DDBJ中去除所有相同核酸序列進(jìn)行整合后所得的最為全面的已知基因數據庫，其中包括部分基因組序列。聯(lián)網(wǎng)至“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi選擇數據庫“Nucleotide”，利用blastn程序進(jìn)行同源性檢索。”, 按照提示進(jìn)行查詢(xún)。
2 比較基因組分析
達爾文的進(jìn)化論給比較基因組學(xué)提供了理論依據。動(dòng)物進(jìn)化從低等到高等，動(dòng)物與動(dòng)物之間存在著(zhù)親緣關(guān)系。這種關(guān)系可以從基因序列上反映出來(lái)。親緣關(guān)系越近，其基因序列的同源性就越高?？梢愿鶕呀?jīng)親緣關(guān)系較大的動(dòng)物的基因序列來(lái)擴增目的基因的序列。
3 利用Unigene數據庫進(jìn)行電子克隆
此分析需要聯(lián)網(wǎng)至“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi選擇數據庫“dbEST”，利用blastn程序進(jìn)行同源性檢索。一般情況下可從EST數據庫中檢索到一批與代分析序列高度同源的EST序列。選擇同源性比分最高的一條EST序列。從NCBI的UniGene數據庫中進(jìn)行檢索，得到相應的UniGene編號。獲得待分析序列的UniGene編號以后，就可以將與UniGene Cluster的所有核酸序列下載到本地，利用SequencherTM或其他的序列裝配軟件進(jìn)行組裝。形成較長(cháng)的新生序列。
4 cDNA序列的開(kāi)放閱讀框分析
大量的實(shí)驗證明，在真核生物起始蛋白質(zhì)合成時(shí)，40S核糖體亞基及有關(guān)合成起始因子首先與mRNA模板靠近5`末端處結合，然后向3`末端滑行，發(fā)現AUG起始MM子時(shí)，與60S大亞基結合形成80S起始復合物。開(kāi)始轉譯蛋白質(zhì)。這就是Kozak提出的真核生物蛋白質(zhì)合成起始的“掃描模式”。MRNA需要翻譯為蛋白質(zhì)方能發(fā)揮生物學(xué)作用，因此，核酸序列的開(kāi)放閱讀框（open reading frame.ORF）的分析便成為核酸分析的一個(gè)重要部分?；谶z傳MM表，可通過(guò)計算機方便分析核酸序列的讀碼框。聯(lián)網(wǎng)至http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orf finder,輸入cDNA序列，計算機將按照六種相位翻譯成蛋白質(zhì)。
5基于核酸序列的電子基因定位
對核酸序列進(jìn)行電子基因定位（即基因的染色體定位），通過(guò)所定位區帶的相鄰基因或者基因簇間接提示該基因的功能，是核酸分析的一個(gè)重要方面。進(jìn)行電子定位一般有兩種策略：（1）通過(guò)序列標簽位點(diǎn)（Sequence Tagged Site,STS）進(jìn)行定位；（2）通過(guò)UniGene/RH技術(shù)進(jìn)行定位。
①利用STS數據庫進(jìn)行電子基因定位
利用此種方式進(jìn)行定位時(shí)主要是利用NCBI的電子PCR資源，即登錄http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/sts/eper.cgi,輸入待分析的序列即可進(jìn)行查詢(xún)。
②利用UniGene數據庫進(jìn)行電子基因定位
參考前述，首現獲得待分析序列所對應的UniGene編號。而大部分UniGene序列已經(jīng)具有較為明確的利用放射性雜交（radiation hybrid,RH）技術(shù)所給出的定位信息，所以，根據此結果就可以得到待分析序列的基因定位。
6 電子表達譜分析
在獲得待分析序列的UniGene編號以后，就可以通過(guò)參與形成UniGene Cluster 的序列的/細胞來(lái)間接地反映待分析序列在何種組織表達，體現在字段“cDNA sources”中。
7基于序列同源性分析的蛋白質(zhì)功能預測
相似的序列很可能具有相似的功能。因此，蛋白質(zhì)的功能預測最為可靠的方法是進(jìn)行數據庫相似性檢索。此方法應至少80個(gè)氨基酸長(cháng)度范圍內具有25％以上的序列一致才提示可能的顯著(zhù)意義。目前一般方法是基于NCBI/Blast軟件的蛋白質(zhì)同源性分析
類(lèi)似于核酸序列的同源性分析，用戶(hù)直接將待分析的蛋白質(zhì)序列輸入NCBI/Blast軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）的序列輸入框內，選擇程序：Blastp”就可聯(lián)網(wǎng)進(jìn)行相應分析。
8 較長(cháng)或全長(cháng)的cDNA序列注冊
進(jìn)行較長(cháng)或全長(cháng)cDNA序列注冊時(shí)，可將其制成一個(gè)注冊文件，其中可包含有多條cDNA序列。用戶(hù)需要將可能多的信息在GenBank所規范的字段中填寫(xiě)。序列注冊文件生成以后，可直接將其以附件方式向NCBI發(fā)送Email(gb-sub@ncbi.nlm.nih.gov)。一般在3－7個(gè)工作日之內可得到回音，并獲得新的GenBank序列接收號。具體過(guò)程如下：下載Sequin軟件；安裝Sequin軟件；運行Sequin.exe文件。按要求回答一系列問(wèn)題，包括作者及單位、核酸序列信息、注解信息等。最后將生成一個(gè)序列注冊文件（擴展名為sqn）?？蓪⒃撐募愿郊问较騈CBI發(fā)送（gb-sub@ncbi.nlm.nih.gov）。
一般地，核酸序列信息分析的基本思路:編碼區序列 (簡(jiǎn)稱(chēng)CDS)與EST數據比較→尋找感興趣ESTS (標準:長(cháng)度≥100bp,同源性介于50%-85%之間 )→所選ESTs與GenEmble數據庫比較→找出未克隆ESTs→再與dbEST、dsSTS、dbHTGs、MGD及UniGene數據庫比較搜尋重疊群Contigs→設計引物進(jìn)行PCR擴增或篩選cDNA文庫或索取cDNA克隆號進(jìn)行電子拼接獲取全長(cháng)cDNA→基因定位、表達、結構、功能檢測分析等。
