1 植物病毒的危害
自第一個(gè)植物病毒——煙草花葉病毒(Tobac comosaic virus)發(fā)現至今，發(fā)現的植物病毒的種類(lèi)已達近千種。病毒侵染植物后，不僅破壞細胞的代謝活動(dòng)，引起植物的病理變化，而且影響植物的生長(cháng)和發(fā)育，降低作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，甚至使植物死亡。植物病毒可通過(guò)葉液、種子、介體、士幾壤等各種途徑傳播，對糧、油、果、菜、花、本等經(jīng)濟作物具有很大的危害性。植物病毒分布廣，繁殖速度快，防治困難，因此有植物“癌癥”之稱(chēng)。隨著(zhù)生態(tài)環(huán)境的惡化和植物種質(zhì)的不斷引進(jìn)，病毒種類(lèi)不斷增多，危害有加重趨勢。據統計，全世界每年由植物病毒造成的經(jīng)濟損失約400億美元。我國是個(gè)農業(yè)人國，植物病毒病發(fā)生較嚴重，造成巨大損失。因此，加強對植物病毒的研究，尋找有效的防治措施，是當前和今后一個(gè)重點(diǎn)和難點(diǎn)。而通過(guò)一些技術(shù)手段，脫除植物所帶病毒是解決營(yíng)養繁殖植物病毒危害的途徑之一，由于具有重大的應用價(jià)值，多種脫除植物病毒的技術(shù)相繼發(fā)展起來(lái)，成為植物生物技術(shù)中最成功的范例之一。
2 病毒脫除理論依據
病毒屬于非細胞生物，其繁殖和生存寄生于其它生物細胞中，因而嚴格的說(shuō)任何藥劑都不能完全解除其危害。為了擺脫病毒的危害，進(jìn)行了不斷的研究探索。White(1934)發(fā)現病毒在根系內是不均勻分布的，越靠近根尖部分病毒越少。Limasset(1949)在芽的分生組織區段也發(fā)現病毒分布的不均勻性。病毒在患病植株上的分布是不均勻的，在老葉及成熟的組織和器官中含量較高，在幼嫩葉及未成熟的組織和器官中含量低。這兩項發(fā)現為莖尖脫毒提供了理論基礎，1952年Morel首先利用莖尖分生組織培養獲得了大麗菊無(wú)病毒植株。此后相繼有馬鈴薯、菊花、蘭花、百合、草莓、鶯尾等莖尖培養脫毒研究成功的報道并對病毒的脫出理論進(jìn)行了諸多研究。
2.1 病毒在植物體內分布不均勻性假說(shuō)
關(guān)于病毒在植物體內分布不均勻性主要有以下五種假說(shuō):
能量競爭:病毒核酸和植物細胞分裂時(shí)DNA合成均需要大量的能量，而分生組織細胞本身很活躍，其DNA合成是自我提供能量自我復制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量來(lái)完成自我復制，因此就得不到足夠的能量，從而就抑制了病毒核酸的復制。
傳導抑制:病毒在植物體內的傳播主要是通過(guò)維管束來(lái)傳播的，但在分生組織中，維管束組織還不健全，從而抑制了病毒向分生組織運輸。
激素假說(shuō):在分生組織中，生長(cháng)素和細胞分裂素水平均很高，因此阻止了病毒的侵入或者抑制病毒核酸的合成。
酶缺乏:病毒的合成可能需要的酶系統在分生組織中缺乏或還沒(méi)建立，因而病毒無(wú)法在分生組織中復制(stache-smith，1968)
抑制因子:認為在分生組織中存在有某種抑制因子。
2.2 病毒傳播途徑
關(guān)于病毒的傳播途徑和方式有較多的報道，其自然傳播途徑有接觸傳播，如感病植株與健康植株的接觸、機械傳播、嫁接傳播等；有通過(guò)某種特定方式與相結合的有機體進(jìn)行傳播，如蚜蟲(chóng)、真菌、線(xiàn)蟲(chóng)、葉蟬、嫡類(lèi)、薊馬、甲蟲(chóng)等:有通過(guò)植株的繁殖部分傳播，如種子、薯塊、花粉等二種途徑。所有病毒都可通過(guò)鱗(塊)莖和嫁接傳病。大多數病毒可汁液傳染，但PLRV等不能汁傳，而是借助蚜蟲(chóng)，獲得病毒后可終生帶毒。
2.3病毒擴散與積累
關(guān)于病毒的增殖、運輸、積累及傳播途徑機制研究表明:許多植物病毒從最初侵染的細胞移動(dòng)到相鄰的健康細胞到達維管束系統之后，能隨著(zhù)光同化作用被動(dòng)地進(jìn)行系統的長(cháng)距離運輸，引起系統侵染。植物病毒細胞到細胞的短距離運動(dòng)是一個(gè)主動(dòng)過(guò)程，其運動(dòng)由病毒所編碼的非結構蛋白一運動(dòng)蛋白所介導。運動(dòng)蛋白與病毒核酸和胞間連扮相互作用，改變胞間連絲允許通過(guò)的最大孔徑(size exclusion limit，SEL)，增加其滲透性，使得病毒核酸以病毒粒子或核糖核蛋白(RNP)的形式通過(guò)胞間連扮到達相鄰的健康的細胞。運動(dòng)蛋白介導植物病毒細胞到細胞運動(dòng)的確切機制尚在探討之中(鄭文光，2003)。病毒的侵染形式是通過(guò)篩管汁液流的轉運而擴散至植物體各部，病毒最終的位置依賴(lài)于初始侵入的葉片的位置，通常植株下部葉片的病毒可轉運至根部，而上部葉片的病毒常轉運至莖尖。病毒的分布常在庫組織，在PVX的研究中己得到很好的證明(馬豐山，2001)。對馬鈴薯PVX和PVY病毒在侵染及運轉速度的研究表明:接種7天后病毒開(kāi)始運轉，17天后(Y病毒為14天)所有被檢測的植株甸甸莖和塊莖中都發(fā)現了較高的病毒含量，其次是心葉(包括生長(cháng)點(diǎn))和接種葉片。病毒含量的高低與接種時(shí)植株大小密切相關(guān)，植株越小，其各器官中的病毒含量越高。病毒運轉部位主要是生長(cháng)速度快的甸甸莖、塊莖和心葉及生長(cháng)點(diǎn)。而隨植株的增大，病毒達到塊莖所需要的時(shí)間越長(cháng)，且春季接種病毒的各部位的病毒含量均比秋季接種的高(王培倫，1999)。長(cháng)期繼代培養的試管苗有可能再次染上病毒，馬鈴薯試管苗在繼代培養兩年后，均發(fā)現有不同程冷的病毒和細菌再停染，只有通過(guò)再次草尖脫毒才能平新復壯(王軍，1992)。楊元軍等(2002)對馬鈴薯兩個(gè)品種組培苗的頂部、中上部、中下部和基部莖段的繼代繁殖試管苗用DAS一ELISA法進(jìn)行PVX和PVY病毒檢測時(shí)發(fā)現，各莖繼代繁殖的試管苗的病毒含量無(wú)顯著(zhù)差異。綜上所述，植物體內本身攜帶病毒或感染病毒后，其病毒在體內可以進(jìn)一步繁殖和侵染。病毒在體內的分布不是均勻的，可以依據病毒本身生物學(xué)特性以及在植物體內分布的不均勻性，配合物理、化學(xué)方法是可能脫除病毒而獲得無(wú)病毒植株的。
2.4 脫毒機理
病毒的遺傳物質(zhì)是核酸，進(jìn)入植物細胞后，隨其一起復制，侵染形式是通過(guò)篩管汁液流的轉運而擴散至植物體各部，引起系統侵染(鄭文光，2006)植株細胞分裂和病毒繁殖之間存在著(zhù)競爭關(guān)系。在受侵染的植株中，頂端分生組織無(wú)毒或含毒量極低，較老組織的含毒量隨著(zhù)與莖尖距離的加大而逐漸增加。分生組織含毒量低的原因可能是：一、在莖尖中存在高水平生長(cháng)素，可抑制病毒的增值。二、在旺盛分裂的細胞中，代謝活性很高，使病毒無(wú)法進(jìn)行復制。三、在植物體內可能存在著(zhù)病毒鈍化系統，它在分生組織中比其他任何區域具有更高的活性。四、植物病毒自身不具有主動(dòng)轉移的能力，無(wú)論在田間病植株間還是在病組織內，病毒的移動(dòng)都是被動(dòng)的。在植物體內，病毒可以通過(guò)維管束組織系統長(cháng)距離轉移，轉移的速度較快，而分生組織中不存在維管束。病毒也可通過(guò)胞間連絲在細胞間轉移，但速度很慢，難以追上活躍生長(cháng)的莖尖。(姜春華，2006)。病毒在植株體內的分布是不均勻的，在莖尖中呈梯度分布。在旺盛分裂的細胞中植物核蛋白合成占優(yōu)勢，在細胞伸長(cháng)生長(cháng)期間病毒核蛋白合成占優(yōu)勢，利用這一原理，加速分生組織細胞的分裂能夠獲得無(wú)病毒植株。Limasset(1949)等進(jìn)一步研究發(fā)現，由病毒感染的植株，不同部位病毒分布不一致。在老葉和成熟的組織及其器官中病毒含量較高；而幼嫩的及未成熟的組織和器官中病毒含量較低，在生長(cháng)點(diǎn)約0.1mm-1.0mm區域，則幾乎不含或含病毒很少。Morle(1952)根據病毒在寄主植物體內分布不均勻的特點(diǎn)，建立了莖尖培養脫毒方法，這種方法主要用于消除病毒以及類(lèi)病毒、類(lèi)菌質(zhì)體、細菌和真菌等病原物(葛勝娟，2005)。
3 傳統的植物脫毒方法及其特點(diǎn)
3.1 熱處理法
熱處理是利用病毒和寄主植物對高溫的忍耐性的差異，使植物的生長(cháng)速度超過(guò)病毒的擴散速度，從而得到一小部分不含病毒的植物分生組織，進(jìn)行無(wú)毒個(gè)體培育(張尊平，1996)。熱處理并不能殺死病毒，只能鈍化病毒的活性，使其在植物體內的增殖減緩或停止，從而失去侵染能力。熱處理也可以加速植物細胞的分裂，使植物細胞在與病毒繁殖的競爭中獲勝(姜春華，2006)。
熱處理的設備一般比較簡(jiǎn)單，具有良好增溫送風(fēng)設備的溫室或者光照培養箱、恒溫水浴鍋都可以。處理植物的成活率依季節而定。夏季為最適合的季節，冬季即使解決照明問(wèn)題，高溫下也容易形成弱苗，難以承受兩周以上的高溫熱處理，春秋季比冬季效果要好，但也遠不如夏季理想，因此要加強管理，注意高溫馴化(胡琳，2000)。Bhardwaj(1998)等發(fā)現在熱空氣處理過(guò)程中，通常溫度越高，時(shí)間越長(cháng)，脫毒效果就越好，但是同時(shí)植物的生存率卻呈下降趨勢。采用變溫處理，比恒溫處理植株死亡率低脫毒效率高。熱處理是不能脫除所有病毒。例如在侵染馬鈴薯的病毒之中，對于PLRV、PVA和PVY不進(jìn)行高溫預處理，脫毒率也相當高，而高溫預處理卻可以顯著(zhù)提高對隊MV、PVX和PVS的去除。一般而言，對于球狀病毒和類(lèi)似紋狀的病毒以及類(lèi)菌質(zhì)體所導致的病害才有效，對桿狀和線(xiàn)狀病毒的作用不大。
3.2 莖（根）尖培養脫毒法
莖尖培養脫毒的依據是:病毒在患病的植株上分布不均勻，在較老的器官和組織內病毒含量較高，在幼嫩的或未成熟的組織和器官中病毒含量較低，而莖尖是植株中最年輕，細胞分裂最活躍的部位;病毒一般通過(guò)維管束轉移，莖尖分生組織沒(méi)有維管束，病毒只能通過(guò)胞間連絲傳遞，趕不上細胞分裂和生長(cháng)的速度，所以它幾乎不含或很少含病毒。植物莖尖中無(wú)毒生長(cháng)點(diǎn)培養，成了去除植物中病毒使植物復壯的重要方法。
莖（根）尖培養是切取莖（根）的先端部分或莖（根）尖分生組織部分進(jìn)行的無(wú)菌培養。是以White(1934)和Limasset（1949）提出的病毒在植物體內分布不均一，植物頂端分生組織幾乎沒(méi)有病毒的原理為依據。嚴格地講，莖尖分生組織僅限于頂端圓錐區，其長(cháng)度不超過(guò)0.lmm。但這么小的莖尖實(shí)際上很難取得，培養成苗的時(shí)間也很長(cháng)。因此，在實(shí)際培養中，常采用帶有葉原基的生長(cháng)錐來(lái)培養。根尖也可以作為脫毒外植體（Jones，1968）。后來(lái)逐漸成為植物脫毒的主要方法。百合脫毒的外植體可以是田間生長(cháng)的珠芽，也可以是鱗片組培獲得的珠芽。一般采用0.2-0.4mm莖尖分生組織最為有效。在國外，從20世紀60年代起就開(kāi)始利用百合莖尖脫毒獲得無(wú)病毒植株，如PhiiliPs于1962年利用百合莖尖培養脫毒成功;采用莖尖脫毒技術(shù)生產(chǎn)出宜興百合脫毒組培苗（席夢(mèng)利，2001）。對帶LSV、CMV、LMoV的鐵炮百合Georgia進(jìn)行莖尖脫毒，經(jīng)4個(gè)月的繼代培養后，脫除病毒（Kim，1996）。用百合脫毒鱗片培養再生籽球的生長(cháng)點(diǎn)作為脫毒的原始材料，也是有效方法（Mori，1971）。植物通過(guò)莖（根）尖培養獲得無(wú)病毒植株的難易程度與品種和感染病毒的種類(lèi)有直接關(guān)系（Vanzaayen，1992）。同時(shí)，與病毒檢測技術(shù)方法相關(guān)，早期均采用指示植物檢測，靈敏度較低，許多并沒(méi)有真正脫除。莖尖脫毒培養的2個(gè)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節是莖尖的成活率和脫毒率。莖尖培養成活率低，褐化是降低莖尖培養成活率的首要因素。褐化的發(fā)生與許多因素有關(guān)，莖尖大小、取材季節、培養方式、激素濃度、基木培養基、培養基添加物都對莖尖褐化有影響，例如莖尖越小，褐化越嚴重、成活率越低。
3.3 熱處理結合莖尖培養脫毒法
由于單獨的熱處理方法脫毒率低，而單獨的莖尖培養對操作的要求較高，所以將二者結合可以提高植物的脫毒率，降低操作難度。植物生長(cháng)的頂端是一段無(wú)毒區，熱處理過(guò)程中，可使原植物生長(cháng)點(diǎn)頂端免疫區得以擴大，使所取莖尖生長(cháng)點(diǎn)大于未經(jīng)熱處理植株的生長(cháng)點(diǎn)，以提高外植體培養成活率（王壯偉，2003）。應用熱處理與莖尖培養相結合方法能夠更加有效脫除病毒。席夢(mèng)利（2001）利用38±1℃，6h或25℃8h熱空氣和50±1℃，40min恒溫水浴結合莖尖培養脫除了宜興百合的CMV病毒。Thomson（1956）將感染X、Y病毒的馬鈴薯放在暗處發(fā)芽，當芽長(cháng)到1-2cm時(shí)用35℃處理7-28d后，取5mm的莖尖培養而獲得了無(wú)毒植株。宋瑞林（1999）利用此方法脫除了切花菊的番茄不育病毒。這2種脫毒方法各有利弊，由于各種病毒鈍化的溫度不同，某一溫度的熱處理不能排除所有病毒。將熱處理和莖尖分生組織培養結合起來(lái)就可取更長(cháng)的莖尖，這樣可大大提高莖尖分生組織培養的成活率，而對脫毒效果沒(méi)有太大的影響。
3.4 抗病毒藥劑法
抗病毒藥劑作用方式主要有以下四種：1）與病毒競爭細胞表面的受體，阻止病毒的吸附。2）阻礙病毒穿入脫殼，如金剛烷胺能抑制流感病毒的脫殼而預防流感。3）阻礙病毒生物合成，如皰疹凈抑制胸腺嘧啶核苷合成酶，影響DNA的合成；核糖腺苷，核糖胞苷干擾DNA聚合酶，阻礙DNA的合成；嗎啉雙胍對病毒增殖周期各個(gè)階段幾乎均有抑制作用（主要是阻抑RNA聚合酶的活性及蛋白質(zhì)的合成）。此外，某些藥物可被由病毒基因編碼的酶（如胸苷激酶）磷酸化，該磷酸化合物為病毒DNA聚合酶的底物，二者結合后就可發(fā)揮抑制酶的作用，因而可阻止病毒DNA的合成，如阿昔洛韋。4）增強宿主抗病能力的物質(zhì)，如干擾素能激活宿主細胞的某些酶，降解病毒的RNA，抑制蛋白的合成，翻譯和裝配。這種方法一般要與莖尖培養相結合應用。
采用病毒抑制劑與莖尖培養相結合的脫毒方法，可以較容易的脫除多種病毒，經(jīng)過(guò)抗病毒藥劑處理的嫩莖，切取莖尖，再進(jìn)行組織培養，會(huì )提高脫毒率和成活率。而且這種方法對取材要求不嚴，接種莖尖可大于1mm，易于分化出苗，提高存活率?；瘜W(xué)療法在百合脫毒上的應用效果，已在鱗片培養和愈傷組織培養試驗中得到肯定?？共《緞┦褂脻舛仍礁?，處理時(shí)間越長(cháng)脫毒效果越加明顯。相反，高濃度抗病毒劑對植株的生長(cháng)有一定傷害。
3.5 愈傷組織培養脫毒
通過(guò)植物器官或組織的培養來(lái)誘導產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化出芽長(cháng)成植株而獲得無(wú)毒苗。利用這種方法先后在百合、甘蔗、馬鈴薯、天竺葵、大蒜和草莓等多種植物上獲得成功。其原理是愈傷組織的某些細胞不帶病毒，這是由于病毒的復制速度趕不上細胞的增殖速度，或者是有些細胞通過(guò)突變獲得了抗病毒的抗性。方法是通過(guò)花卉各種器官或組織誘導產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再誘導分化產(chǎn)生芽，長(cháng)成小植株，可以得到無(wú)病毒苗。劉文萍等人用唐葛蒲花蕾進(jìn)行離體培養，可脫除煙草花葉病毒，脫毒率為60%。這種方法的缺陷是植株遺傳性不穩定，可能會(huì )產(chǎn)生變異植株，并目一些植物的愈傷組織尚不能產(chǎn)生再生植株。
3.6 其他脫毒方法
除了以上這些脫毒方法，花藥培養法、花芽培養、胚珠培養法和莖（根）尖徽體嫁接等也可用于植物脫毒。單一的脫毒處理技術(shù)一般難以完全脫除病毒或需要較長(cháng)的時(shí)間，多種脫毒技術(shù)的組合使用逐漸成為生產(chǎn)無(wú)毒百合種苗的首選。Blom-Barnhoorn（1985）采用莖尖脫毒+40 mM病毒唑處理的方法將百合品種Arai帶毒率從61%降為35%。徐品三（1999）對鱗片在35℃下處理4周后在含5mg/L（毫克/升）病毒唑的培養基中誘導珠芽，最終70%的‘Georgia’和94%‘Casablanca’珠芽病毒檢測呈陰性。
4 低溫脫毒療法
4.1低溫療法脫毒原理
低溫療法是基于超低溫保存對細胞的選擇性破壞作用的原理，結合組織培養和病毒檢測技術(shù)達到脫毒的目的。超低溫保存是指在-80攝氏度以下的超低溫條件下保存種質(zhì)資源的一整套生物技術(shù)?，F在常用液氮做冷源，超低溫保存的原理是在超低溫條件下，細胞的全部代謝活動(dòng)近乎完全停止，人大減慢甚至終比代謝和衰老過(guò)程，保持生物材料的穩定性，減少遺傳變異的發(fā)生，達到一長(cháng)期保存的目的。莖尖分生組織的分化程度小，再生相對容易等優(yōu)點(diǎn)，被認為是較為理想的種質(zhì)超低溫保存材料。至今己對近200多種植物材料的莖尖成功的進(jìn)行了超低溫保存。作為一種新的脫除植物病毒的方法，已成功的用于幾種植物病毒的脫除，低溫療法以其相對簡(jiǎn)單的操作方法和高脫毒率將為植物病毒的脫除帶來(lái)新的希望。超低溫保存與莖尖培養相結合是植物脫毒和保存莖尖的一種新方法。分化的、含有病毒的植物細胞液泡較大，液泡中含有的水分也較多，在超低溫保存過(guò)程中易被形成的冰晶破壞致死，而增殖速度較快的分生組織中液泡較小或不含液泡，因而含水量相對較少，胞質(zhì)濃，抗凍性強，不宜被凍死。光學(xué)顯微鏡觀(guān)察顯示液氮中的超低溫能殺死含較大液泡的細胞，而保存液泡小的頂端分生組織細胞。這樣超低溫處理過(guò)的植株再生后大多是無(wú)病毒的。
4.2 低溫療法的優(yōu)點(diǎn)
低溫療法脫除植物病毒不但避免了傳統的莖尖培養脫毒中在顯微鏡下切取莖尖過(guò)程的操作困難，免除了在切取分生組織時(shí)由于操作時(shí)間過(guò)長(cháng)和多酚的氧化而導致的莖尖黑化問(wèn)題，而且脫毒率高，具有傳統方法無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)。研究表明，對莖尖進(jìn)行超低溫保存是脫除植物病毒的一種簡(jiǎn)單、快速而有效的方法，是植物脫毒的一種新途徑。另外，該技術(shù)還可以使植物脫毒與種質(zhì)保存相結合，實(shí)現脫毒原種的長(cháng)期保存。隨著(zhù)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，低溫療法在植物病毒防治方面有可能會(huì )發(fā)揮重要作用。
4.3 超低溫保存技術(shù)
超低溫保存技術(shù)根據冷凍-脫水方法的不同分為逐步冰凍法、脫水干燥法、包埋-脫水法、玻璃化法、包埋-玻璃化法、微滴-玻璃化法6種方法，其中應用最為普遍的是玻璃化法超低溫保存。
4.3.1 玻璃化法
玻璃化（Vitrification）即將細胞或組織置于由一定比例的滲透性和非滲透性保護劑組成的玻璃化溶液中，使細胞及其玻璃化溶液在足夠快的降溫速率下過(guò)冷到玻璃化轉變溫度（Glassy transition temepreture，Tg），從而被固化成玻璃化態(tài)（非晶態(tài)），并以這種玻璃態(tài)在低溫下保存。玻璃化法超低溫保存是Luyet于1937年首次提出的，之后經(jīng)過(guò)長(cháng)期的理論和實(shí)踐探索，于20世紀80年代才發(fā)展起來(lái)。自1968年Ralph利用玻璃化法超低溫保存亞麻懸浮細胞以來(lái)，1989年Langis和Uragami et al.相繼證實(shí)了油菜和蘆筍玻璃化凍存植物材料同樣是可行的。Schnabel-Preikstas et al.(1992)首先介紹了甘薯的低溫保存應用，切取1mm的芽尖包換頂端生長(cháng)點(diǎn)中的兩個(gè)葉原基，在0.4M的蔗糖中預培養，接著(zhù)在玻璃化溶液中脫水，玻璃化溶液是在MS培養基中加入50%(w/v EG)乙烯乙二醇,15%(w/v)sorbitol山梨醇和6%(w/v)BSA牛血清蛋白。然后放入液氮中低溫保存。低溫保存的莖尖細胞在含有1.5M的山梨醇的MS培養基中解凍，在含有生長(cháng)素和激動(dòng)素的固體MS培養基中后續培養用于恢復。結果：有71%的莖尖細胞經(jīng)過(guò)液氮保存后存活，但是大部分莖尖形成愈傷組織后沒(méi)有再生長(cháng)，只有23%的存活莖尖在生長(cháng)出新莖。與傳統的超低溫保存方法相比，玻璃化法以其要求設備簡(jiǎn)單、材料處理步驟簡(jiǎn)便、省時(shí)省力、效果和重復性好等優(yōu)點(diǎn)倍受人們推崇，成為較為理想的植物種質(zhì)資源保存方法，并且在復雜的組織和器官的超低溫保存方面有較好的應用潛力，是目前研究者多采用的超低溫保存方法。玻璃化法超低溫保存解決了莖尖或分生組織傳統方法中只有一部分材料成活的技術(shù)問(wèn)題。
4.3.2 微滴玻璃化
微滴玻璃化過(guò)程中，材料在滲透劑中預培養，用裝載溶液裝載材料，用玻璃化溶液PVS2脫水，在鋁箔上分別加入4-15微升小滴的PVS2，PVS2是包含30%(w/v)glycerol甘油,15%(w/v)乙烯乙二醇,15%(w/v)DMSO 0.4 M蔗糖的MS培養基，然后直接放入液氮中。裝有低溫保存過(guò)的材料直接放入富含蔗糖的液體培養基中進(jìn)行解凍和卸載，再用后續培養基培養培養莖尖用于存活和再生。Towill and Jarret(1992)對甘薯莖尖的微滴玻璃化研究中，從體外8-12周的植物腋芽上切取0.5-0.7mm的莖尖包含3-4個(gè)葉原基。用上述的方法處理后，兩個(gè)不同的基因型獲得了91%和26%的存活率嗎、，但是再生率很低。存活的莖尖先形成愈傷組織，在從中心部分生長(cháng)出新莖，但是不是所有的存活的莖尖都不能從愈傷組織中生出新莖。Pennycooke and Towill(2000)改進(jìn)實(shí)驗過(guò)程：從體外4-8周經(jīng)過(guò)8小時(shí)黑暗處理的植物上切取0.5-1mm的莖尖包含2-3個(gè)葉原基，在0.3M蔗糖中預培養，在包含2M甘油和0.4M蔗糖的MS培養基裝載溶液中裝載，在22℃的PVS2的玻璃化溶液中脫水，把含有一個(gè)莖尖10微升的PVS2的微滴放在40×2大小的鋁箔上。先放入-208℃液氮泥中15-30分鐘，再放入液氮中。被低溫保存的莖尖在包含1.2M蔗糖的液態(tài)MS培養基解凍20分鐘，保持22℃的環(huán)境條件。然后在包含0.2mg/l NAA,1.1 mg/l BA 0.2 mg/l mg kinetin MS培養基中后續培養莖的再生。實(shí)驗結果：66%的莖尖經(jīng)過(guò)低溫保存后存活，所有的存活的莖尖再生出新莖，形成非常小的愈傷組織，而且新莖是可以再生的。微滴玻璃化得主要優(yōu)點(diǎn)在于，他通過(guò)鋁箔上極小微滴的體積建立一個(gè)高的冷卻、升溫速率，有非常高的再生率，能夠廣泛的應用到各種不同的植物組織。這個(gè)方法是低溫保存馬鈴薯的最理想的方法，更多的研究需要測試這個(gè)方法多其他基因型的應用性。
4.3.3 包埋脫水
包埋脫水也是玻璃化的基本方法，用這個(gè)技術(shù)可生產(chǎn)人工種子。由于脫水型較高的外植體中大部分或者全部的結晶水從細胞中移除，玻璃化的溶液在液氮中迅速結晶，避免了水結成冰的損傷。這步驟需要將材料用2-3%藻酸鈉溶液包埋，來(lái)增加材料在脫水和低溫過(guò)程的忍耐力，然后用熱蒸汽或者硅膠脫水。脫水的材料組織直接放入液氮中。低溫保存可以選擇慢速解凍和在35-38℃的條件快速解凍，然后在后續培養基上培養存活再生。Pennycooke and Towill(2001)對甘薯莖尖的研究中：從離體4-8周的植物莖的頂芽上切取0.5-1mm長(cháng)的莖尖包含2-3個(gè)葉原基，包埋在直徑4-5mm的小珠內。將其逐步在液態(tài)的MS培養基內預培養，培養內的蔗糖逐步增加分別為0.25M、0.5M、0.75M分別培養一天的時(shí)間。然后用熱空氣脫水減少18.1%的水分濃度，脫水后直接放入液氮泥中15-30分鐘，再轉移至液氮中。低溫保存過(guò)的包含莖尖的小珠在30℃液態(tài)的含0.06M蔗糖的MS培養基中解凍5秒鐘，轉移至不含銨根離子的含有0.2mg/l NAA,0.1mg/lBA,0.2mg/l kinetin和0.09 Msucrose的固體MS培養基中后續培養。前兩天在黑暗中培養，莖尖從小珠中提取出來(lái)，再用同樣的培養基在光下培養3天，最后把莖尖轉移至標準的MS培養基中培養再生。結果：67%的低溫保存過(guò)的莖尖再生出新莖。這個(gè)技術(shù)便于操作，可以處理大量相似的實(shí)驗樣本，結果通常有高的存活率，新莖嫩迅速直接從低溫保存的莖尖再生出來(lái)。更重要的是，至用蔗糖作為冷凍保護劑，避免了像DMOS這些冷凍保護劑的毒害作用。唯一的不足是，在脫水階段時(shí)間消耗較長(cháng)。
4.3.4 包埋玻璃化
包埋玻璃化處理中，藻酸包埋的材料莖尖在富含蔗糖的培養基中預培養，在裝載溶液中裝載，然后用玻璃化溶液脫水，再直接放入液氮中。低溫保存的莖尖解凍后，用卸載溶液移除玻璃化溶液，在后續培養基中培養再生。Hirai and Sakai(2003)對甘薯莖尖的研究中：先是將8mm長(cháng)的節間在包含0.09 Msucrose,1g/lcasamino acids,0.5mg/lBA的MS培養基中培養，在25度持續16小時(shí)的光周期條件下。經(jīng)過(guò)10-14天的培養，從頂芽上切取1mm長(cháng)的莖尖包含3-4個(gè)葉原基，包埋在直徑4mm的小珠內。在包含0.09 Msucrose and 1g/lcasamino acid的液態(tài)MS培養基中培養，在90 rpm的旋轉器上25度得條件下培養24小時(shí)。再轉移至包含0.3M蔗糖的液態(tài)MS培養基中預培養16小時(shí)。預培養的莖尖用包含2Mglycerol and 1.6 Msucrose的液態(tài)MS培養基裝載，在60rpm的旋轉器上25攝氏度下持續3小時(shí)。用PVS2脫水60分鐘，在旋轉器上60rpm25℃的條件下。然后直接放入液氮中。低溫保存的莖尖在38℃的條件下解凍2分鐘，用1.2M蔗糖溶液卸載20分在25℃的條件下，放在包含0.5 mg/l BA、1mg/l GA3的MS培養基培養7天，再轉移至包含1 mg/l GA3不含BA的MS培養基中培養。在21天的后續培養中正常的莖再生，沒(méi)有形成愈傷組織。平均的莖的再生速率超過(guò)了80%。這個(gè)技術(shù)避免了包埋脫水的長(cháng)時(shí)間脫水，是最有希望的應用方法。
4.4 冷凍療法脫毒
4.4.1 冷凍療法的脫毒機理
冷凍療法脫毒是結合低溫保存技術(shù)和組織培養技術(shù)發(fā)展形成的新型脫毒技術(shù)。莖尖用于微繁殖的都是頂端或莖的分裂組織，包含3-4個(gè)葉原基，尺寸在1-1.5mm之間，新生的分生細胞通常沒(méi)有病原體，如病毒植原體細菌。在底層的有大液泡的細胞更容易被病毒感染，在液氮冷凍處理階段，這些細胞都被殺死，頂層的細胞沒(méi)形成較大的液泡，細胞液濃的細胞如AD、LP1、LP2不易被感染在冷凍處理中存活下來(lái)，應用包埋脫水法和玻璃化法處理可以避免形成冰晶損壞細胞，結合組織培養技術(shù)將低溫處理的材料細胞培養成植株，因此，經(jīng)過(guò)冷凍處理再生的植株是無(wú)毒的。
4.4.2 冷凍療法脫毒的特點(diǎn)：
與傳統的熱療法和組織培養脫毒法相比，用傳統的組織培養的脫毒方法面臨著(zhù)培養極小的組織的困難，培養材料的尺寸影響著(zhù)存活率和再生的脫毒率，操作非常麻煩，不能用于大量的樣本的生產(chǎn)。由于冷凍法脫毒不依賴(lài)莖尖的尺寸大小，操作非常容易簡(jiǎn)單，可以用于大量的樣本生產(chǎn)，冷凍療法脫毒的存活率和再生率相比較低，但是其脫毒率非常高。與傳統的組培方法比，冷凍法用更少的再生莖尖去鑒定脫毒效果鑒定。低溫方法效用性高，不需要特別的設備，液氮產(chǎn)生的低溫條件實(shí)驗成本低廉，便于處理大量的實(shí)驗樣品，主要得限制條件是不同的基因型需要不同低溫處理協(xié)定，需要更多的研究擴大應用范圍。
冷凍療法脫毒的現況在1997年,Brison首次說(shuō)明低溫不存不僅可以保存種質(zhì)資源還可以用于脫毒，經(jīng)低溫處理的李樹(shù)的莖尖脫去了50% PPV病毒。(Brisonetal.l997).前不久，低溫療法脫毒可從塊根塊莖類(lèi)作物莖尖脫去7種不相關(guān)的病原體，比如馬鈴薯、甘薯;果樹(shù)里可應用低溫脫毒的種類(lèi)包括：柑橘、薔薇科,漿果類(lèi)、香蕉。對甘薯的兩種病毒SPFMV和SPCSV的脫毒研究，從幼莖上取1cm長(cháng)的節間，表面消毒殺菌后，外植體在包含2mg/l calciumpantho-tenate,200 mg/lascorbicacid,20mg/lputrescine,100mg/larginine,10mg/lcalciumnitrate0.09Msucrose的MS培養基中培養，經(jīng)過(guò)3周的培養，從頂芽取1.0-1.5mm大小的莖尖包含3-4個(gè)葉原基，用包埋玻璃化的方法處理，再晶冷凍處理后，在后續培養中再生。解凍后的小珠在含0.5mg/lBP不含銨根離子的MS培養基中培養5-7天，存活的莖尖再轉移到含5–10mg/lGA3和銨根離子的MS培養基中培養。結果：83-87%莖尖存活，87%的存活莖尖再生出新莖。經(jīng)過(guò)TAS-ELISA和RT-PCR對兩種病毒的鑒定，SPFMV和SPCSV脫毒率為100%。然而，同樣材料的莖尖通過(guò)組培的方式脫毒，脫毒率僅為10%和7%。QiaochunWang（2003）對VitisviniferaL該種葡萄的GVA病毒的冷凍療法的研究對植株的培養，在基礎培養基（MS培養基包含3%sucrose和solidifiedwith 0.26% gellangum）培養16小時(shí)控制溫度在24℃，每4個(gè)星期做一次次生培養。切取1mm長(cháng)的莖尖，對其進(jìn)行包埋脫水處理，0.1MCaCl2溶液其中包含2 Mglycerol and 0.4Msucrose在室溫下處理30分鐘形成小珠，每一個(gè)里面包含一個(gè)莖尖。在蔗糖濃度分別為0.250.50.751.0M的BM培養基里培養4天，一個(gè)梯度培養一天。在濾紙上用用熱空氣除水7小時(shí)，脫水之后放入液氮中處理1小時(shí)。為了鑒定不同梯度包埋脫水對脫毒的效果，包埋的小珠在不同的梯度條件下下再生長(cháng)，產(chǎn)生的植株用于GVA的測試。切取1mm長(cháng)的莖尖在不同蔗糖濃度的BM培養基中預培養，0.250.50.75M各1天，預培養的莖尖與2 Mglycerol0.75 Msucrose溶液培養60分鐘溫度在25度。之后用PVS2溶液玻璃化處理，在0度得條件下處理50分鐘，然后轉移至液氮中處理1小時(shí)。冷凍處理后的莖尖在40度得水浴條件下解凍，用1M蔗糖25℃的MS培養基沖洗，后續培養再黑暗的條件下24℃里保持2天，再轉移至莖的培養基存活培養，6周之后長(cháng)度超過(guò)3mm的轉移的固體BM培養基培養再生完整植株。實(shí)驗結果：在包埋預處理的過(guò)程中，莖尖的存活率是100%，脫水之后減少到82%，再經(jīng)過(guò)液氮的冷凍，只有60%的莖尖存活下來(lái)。跟據對GVA的鑒定，在控制包埋預處理和脫水的處理中，沒(méi)用清出GVA，在冷凍階段清除了GVA，通過(guò)對比97%存活再生的植株沒(méi)有GVA病原體。
4.4.3 冷凍療法脫毒的難題與發(fā)展
目前應用中存在的技術(shù)難題：低溫處理后的莖尖存活和再生率低，是低溫保存和冷凍脫毒的應用難題，結合傳統的組培方法研究培養基組成成分對材料的生長(cháng)的促進(jìn)與抑制作用，在改進(jìn)預培養基和后續培養基的成分是未來(lái)工作研究的重點(diǎn)，在玻璃化脫水處理中減少冷凍保護劑的毒害最用能提高莖尖的存活和再生率，對冷凍保護劑的研究也是未來(lái)研究的重點(diǎn)。對再生植株的基因鑒定及脫毒植株的病原體鑒定也是未來(lái)研究的重點(diǎn)。
5、幾種超低溫脫毒方法操作模式
5.1、玻璃化法走超低溫脫毒操作模式（以馬鈴薯為例）
5.1.1、技術(shù)路線(xiàn)
建立馬鈴薯無(wú)菌苗擴繁體系—預培養莖尖—裝載處理—玻璃化保護劑脫水處理—投入液氮——解凍后洗滌—恢復培養—脫毒檢測
5.1.2、試驗材料
5.1.2.1、植物材料：
釆用優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)主栽品種，選取健壯馬鈴薯帶芽莖段作為外植體，接種到MS+KT 0.04+IAA 0.5+GA 0.5+糖30g/L+瓊脂7g/L培養基上，在溫度25℃、光照1600～3000lx、光照時(shí)間為14h/d條件下培養，無(wú)菌苗毎3周進(jìn)行一次繼代培養，以擴繁后的無(wú)菌苗作為試驗材料。
5.1.2.2、儀器設備
北京中科起源科技有限公司可提供一下儀器設備：超凈工作臺、高壓滅菌鍋、1.8ml冷凍管、恒溫培養箱、恒溫水浴箱、液氮罐、玻璃棒、膠頭滴管、PH試紙、燒杯、量筒、酒精燈、封口膜、解剖鏡、剪刀、鑷子、分析天平、三角瓶、容量瓶、移液槍、無(wú)菌濾紙、記號筆、標簽紙、數碼相機等。
5.1.2.3、主要試劑
北京中科起源科技有限公司可提供一下試劑：蔗糖、瓊脂、BA、NAA、GA3、IAA、KT、升汞、酒精、NaOH、甘油（Gly)、二甲基亞砜（DMSO)、乙二醇（EG)、液氮（LN）等。
5.1.3、試驗方法
5.1.3.1、外植體建立：
采用健壯的馬鈴薯幼嫩莖段，洗凈外表泥土，用自來(lái)水沖洗1h,在超凈工作臺上用75%酒精消毒5s,快速用無(wú)菌水沖洗二次，再用0.1%升汞溶液消毒8min,無(wú)菌水沖洗5次，用無(wú)菌濾紙吸干莖段表面水分，截取長(cháng)約1.5cm莖尖、莖段，接種到MS培養基上進(jìn)行初代培養，30d后用于繼代擴繁。
5.1.3.2、繼代培養
選取無(wú)菌苗切取1cm左右莖段，接種到最佳繼代培養上MS+KT 0.04+IAA 0.5+GA 0.5+糖30g/L+瓊脂7g/L培養基上，在溫度25℃、光照1600～3000lx、光照時(shí)間為14h/d條件下培養30d左右待用。第一次繼代培養30d左右，之后繼代20～25d。
5.1.3.3、建立馬鈴薯超低溫保存體系：
5.1.3.3.1、低溫鍛煉：
選用繼代三次馬鈴薯無(wú)菌苗置于4℃暗培養箱中低溫鍛煉1周待用。
5.1.3.3.2、預培養
選取繼代4周左右生長(cháng)健壯的馬鈴薯莖段10mm接種于附加不同蔗糖濃度的MS培養基為4℃暗培養箱中預培養，蔗糖濃度分別設6個(gè)處理（0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L、0.9mol/L、1.2mol/L），寫(xiě)好標簽備用。
5.1.3.3.3、裝載處理
在無(wú)菌條件下，剝取長(cháng)約2～3mm經(jīng)過(guò)預培養后的莖尖，剝離后迅速轉移到1.8ml的冷凍管中，毎管10個(gè)莖尖。將高壓滅菌后的裝載液吸入含有莖尖的冷凍管中，于室溫處理一定時(shí)間，裝載時(shí)間設置6個(gè)處理。裝載液（LS)要求必須經(jīng)過(guò)高壓滅菌，并且PH嚴格控制在5.8，裝載液組成為：2mol/L甘油+4mol/L蔗糖，寫(xiě)好標簽備用。
5.1.3.3.4、玻璃化保護劑脫水
用滅菌?頭滴管吸取玻璃化保護劑PVS2于裝載后的冷凍管中，于0℃下處理不同時(shí)間（0min、20min、30min、40min、60min、80min）。PVS2組成為：MS液體培養基+30%（w/v)甘油（Gly)+15%(w/v)乙二醇（EG)+5%(w/v)二甲基亞砜（DMSO)+0.4mol/L蔗糖。高壓滅菌PVS2溶液，PH5.8,寫(xiě)好標簽備用。
5.1.3.3.5、液氮保存
將玻璃化液處理后的莖尖移去原液，換取新鮮的PVS2,將冷凍管密封好套上一根線(xiàn)迅速投入液氮罐中至少保存1h,冷凍時(shí)間設6個(gè)處理（1h、1d、7d、10d、14d、30d），寫(xiě)好標簽備用。
5.1.3.3.6、解凍及洗滌
從液氮罐中取出冷凍管在40℃恒溫水浴鍋中快速化凍90s,用無(wú)菌膠頭吸管快速除去冰凍保護液，用洗滌液洗滌2次，每次10min。洗滌液（MS液體培養基+1.2mol/L蔗糖）經(jīng)過(guò)高溫滅菌，PH5.8。
5.1.3.3.7、恢復培養
將洗滌過(guò)的莖尖轉入再生培養基MS+BA3+NAA0.1+GA5+30g/L糖+瓊脂7g/L暗培養5d后轉入正常光照下培養，2周后統計成活率即有部分恢復綠色莖尖占全部莖尖數的百分比，4周后統計再生率即成活莖尖數占全部試驗莖尖數的百分比。
5.1.3.3.8、病毒檢測
5.2、小滴玻璃化法低溫脫毒操作模式
5.2.1、技術(shù)路線(xiàn)
建立無(wú)性系—莖尖分生組織剝取—預培養—裝載—玻璃化保護劑脫水處理—液氮保存—快速化凍—恢復培養—正常培養—痛毒檢測
5.2.2、試驗材料：
5.2.2.1、植物材料
芋頭
5.2.2.2、儀器設備
北京中科起源科技有限公司可提供一下儀器設備：雙目解剖鏡、Mdcartney或1.8～2ml冷凍管、過(guò)濾滅菌器、濾紙、磁力攪拌器、一次性針管、5mm*20mm鋁箔條若干、冰箱、冰盒、鑷子、解剖刀、燒杯等。
5.2.2.3、主要試劑
北京中科起源科技有限公司可提供一下試劑：蔗糖、瓊脂、BA、NAA、少GA3、IAA、KT、升汞、酒精、NaOH、甘油（Gly)、二甲基亞砜（DMSO)、乙二醇（EG)、液氮（LN）等。
5.2.3、試驗方法
5.2.3.1、材料獲得
選取繼代2～3個(gè)月的外植體，在無(wú)菌條件下，用雙目解剖鏡剝取0.8～1mm莖尖，包含1～2個(gè)幼嫩葉原基的頂端分生組織及基部約1mm3的原組織。
5.2.3.2、預培養
將剝離的莖尖放入含有0.3mol/L蔗糖固體培養基中，正常培養條件下進(jìn)行1d以上的培養。
5.2.3.3、Loading裝載
預培養后的莖尖轉移到McCartney瓶（也可以用1.8ml或2ml冷凍管）中，瓶?jì)妊b有5ml已過(guò)濾滅菌的裝載液（2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖+MS,PH5.8),在25℃室溫下處理20min后，將莖尖轉移到無(wú)菌濾紙上停留30s,吸除多余的裝載液。也有研究認為裝載這一步可以刪除，不影響凍存效果。
5.2.3.4、脫水處理
將材料在0℃下放入裝有玻璃化液PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.4mol/L蔗糖+MS,PH5.8)的McCaytney瓶進(jìn)行20～40min脫水處理，磁力攪拌器以60rpm進(jìn)行混勻。利用無(wú)菌的一次性針管吸取5～8滴玻璃化液（每滴4～15ul)滴到已消毒的鋁箔條上（5mm*20mm),將脫水后的莖尖轉到鋁箔條上的玻璃化液滴里，每滴約含5個(gè)莖尖。鋁箔條在使用前5min左右置于冰盒中降溫至0℃左右。
5.2.3.5、液氮保存
脫水處理后，用鑷子將附有莖尖的鋁箔條直接浸入液氮至液氮停止沸騰，然后迅速將其轉入2ml裝滿(mǎn)液氮的冷凍管中至少保存1h以上
5.2.3.6、解凍及洗滌
用鑷子從液氮中取出冷凍管中的鋁箔條，室溫下迅速浸入已滅菌的洗滌液（MS液體培養基+1.2mol/L蔗糖）中，洗滌15min,或將鋁箔條先浸入用40℃溫水預熱過(guò)洗滌液約30s后轉入新鮮洗滌液洗滌。
5.2.3.7、恢復培養
將洗滌后的莖尖先轉到含0.3mol/L蔗糖的固體MS培養基上培養，培養基上方鋪二層巳消毒的濾紙，進(jìn)行恢復培養，室溫下（25℃）暗培養一夜，爾后將莖尖轉接到含0.1mol/L蔗糖固體MS培養基上于黑暗條件下培養5d后，轉到弱光條件下培養10d.以后轉入正常培養。
5.2.3.8、病毒檢測
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