馬鈴薯莖尖分生組織培養脫毒技術(shù)規程
馬鈴薯病毒的危害已成為當前馬鈴薯生產(chǎn)上的嚴重問(wèn)題，造成馬鈴薯生長(cháng)受到抑制、形態(tài)畸變、產(chǎn)生葉面皺縮、花葉、雜斑等許多癥狀，導致薯塊品質(zhì)變劣，產(chǎn)量大幅度下降，最終失去利用價(jià)值，這就是通常說(shuō)的馬鈴薯退化現象。馬鈴薯莖尖分生組織培養是解決馬鈴薯退化的最有效的方法，它是根據病毒在植株體內分布不均勻性及越靠近新生組織部位（如莖尖和根尖頂端生長(cháng)點(diǎn)、新生芽的生長(cháng)錐等處）病毒含量越少的原理，結合使用鈍化病毒的熱處理方法，通過(guò)剝取莖尖分生組織進(jìn)行培養獲得脫毒植株。目前除了一些類(lèi)病毒外絕大多數植物病毒幾乎都能通過(guò)莖尖分生組織培養的方法脫除。這一技術(shù)具有周期短、效率高、能與組織培養快速繁殖相結合等特點(diǎn)，在馬鈴薯上得到普遍應用。昆明市農科院生物所組培室長(cháng)期至力于馬鈴薯優(yōu)良品種的脫毒復壯工作，從2005年底至今已成功對30多份馬鈴薯優(yōu)良品種進(jìn)行病毒脫除，使其恢復了原有的優(yōu)良性壯，并推廣到省內和市內的各馬鈴薯主栽區，為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展做出了一定的貢獻。我們所采用的馬鈴薯莖尖脫毒技術(shù)的操作過(guò)程歸納如下：
1．材料的選擇
實(shí)踐證明，同一個(gè)品種個(gè)體之間在產(chǎn)量上或病毒感染程度上都有很大的差異。進(jìn)行莖尖分生組織培養之前，應于生育期，對準備進(jìn)行脫毒復壯的馬鈴薯品種或材料，進(jìn)行田間株選和薯塊選擇，選擇具有該品種典型特性、生長(cháng)健壯的單株（或無(wú)性系），結合產(chǎn)量情況，選擇高產(chǎn)、大薯率高、無(wú)病斑的單株作為莖尖脫毒的基礎材料，以提高脫毒效果。由于馬鈴薯紡錘塊莖類(lèi)病毒?。≒STV）在目前用植物莖尖分生組織方法很難脫掉，在進(jìn)行莖尖剝離脫毒前，應先對入選的塊莖進(jìn)行PSTV檢測，淘汰帶有PSTV的薯塊，以免前功盡棄。
2．熱處理
為提高脫毒效果，脫毒材料在進(jìn)行莖尖組織剝取前，應進(jìn)行材料的熱處理，以鈍化病毒的活性，消除馬鈴薯卷葉病毒，提高脫毒效果。把入選的馬鈴薯塊莖進(jìn)行打破休眠和催芽處理，當薯塊頂芽生長(cháng)至1厘米后，轉入光照培養箱內，以每天12小時(shí)光照，照度3000LX，37℃的高溫處理6-8周。
3．取材和消毒
剪取經(jīng)過(guò)熱處理后發(fā)芽塊莖上2－3厘米長(cháng)的芽若干個(gè)，用軟毛刷輕輕逐個(gè)刷洗后放于燒杯中，用紗布封口，放于自來(lái)水下沖洗半小時(shí)，然后在超凈工作臺進(jìn)行嚴格消毒：先用75%的酒精浸15秒，無(wú)菌水沖洗2次；再用0.1%的升汞浸泡8-10分鐘（或用5%次氯酸鈉浸泡15－20分鐘），無(wú)菌水沖洗5-8次，每次3-5分鐘（用無(wú)菌水沖洗過(guò)程中要不斷的晃動(dòng)放置材料的容器，以保證漂洗更徹底），沖洗完后放在滅過(guò)菌的培養瓶?jì)却谩?br>
4．剝離莖尖和接種
在超凈工作臺上，將消毒過(guò)的芽置于40X的解剖鏡下，一手用一把眼科鑷子將芽按住，一手用滅過(guò)菌的解剖針將葉片一層一層仔細剝掉，直至露出圓亮的生長(cháng)點(diǎn)，用鋒利的無(wú)菌解剖針小心切取0.3毫米以下的帶1-2個(gè)葉原基的莖尖，隨即將莖尖接種于已準備好的馬鈴薯莖尖培養基上，以切面接觸瓊脂。要注意確保所切下的莖尖不能與已剝去部分、解剖鏡臺或持芽的鑷子接觸。另外，在剝離過(guò)程中，必須注意使莖尖暴露的時(shí)間越短越好，因為超凈臺的氣流和酒精燈發(fā)出的熱都會(huì )使莖尖迅速變干。所以在選擇解剖鏡的燈源時(shí)，盡量以冷光燈為好，同時(shí)在材料下墊一張滅過(guò)菌的濕濾紙保濕，每剝一個(gè)莖尖后，換一張無(wú)菌濕濾紙。
由于塊莖萌發(fā)的芽的數量有限，加上剝離過(guò)程中難免損傷到莖尖，導致可剝離的莖尖量少、成苗的機率小，易造成優(yōu)良品種和材料的丟失。經(jīng)過(guò)多年的實(shí)踐，我們總結出一種行之有效的方法：取經(jīng)嚴格消毒過(guò)的塊莖芽（1厘米長(cháng)）接種在不含任何激素的馬鈴薯快繁培養基上，于25℃的溫度，每天光照12小時(shí)的培養室培養，3-4周后，待芽長(cháng)成含4-5片葉子的小苗時(shí)，剪切成單節段，轉接于同樣的無(wú)激素MS培養基上，培養成苗。同樣方法擴繁1-2個(gè)周期，等苗達一定數量后，再直接用這些苗來(lái)剝離莖尖，既能保證材料不丟失，又能增加莖尖的數量，從而能增加成苗的機率。
5．莖尖培養與病毒檢測
5．1 培養基
選擇合適的培養基是莖尖培養成功與否的關(guān)鍵，根據我們的經(jīng)驗，以MS+GA30.2毫克/升+6-BA0.5毫克/升+NAA0.05+肌醇100毫克/升+D－泛酸鈣0.2毫克/升+食用白糖3%+瓊脂0.6%，PH5.8，為比較好的培養基組合。
5．2 培養
莖尖培養對培養器皿無(wú)特殊要求，一般以150毫升三角瓶或250毫升罐頭瓶，每瓶裝40毫升培養基，為節約培養基，每瓶接種2-3個(gè)莖尖，均勻分布于培養基表面。接種好的莖尖放在培養室內培養，溫度18-25℃，光照2000-3000LX，每天光照12小時(shí)。培養兩周后，培養瓶?jì)鹊那o尖生長(cháng)點(diǎn)便明顯變大變綠，30-40天即可看到明顯伸長(cháng)的小莖，葉原基形成可見(jiàn)的小葉，這時(shí)可轉入無(wú)激素的MS培養基中，小苗繼續生長(cháng)，并形成根系，4-5個(gè)月后即可發(fā)育成3-4個(gè)葉片的小植株，將其按單節切段，進(jìn)行擴繁，成苗后，用于病毒檢測。
5．3病毒檢測
由莖尖分生組織培養獲得的小苗，經(jīng)第一次擴繁后要對其進(jìn)行嚴格的病毒檢測，以確定材料的脫毒情況。一般采用指示植物鑒定法、電鏡檢測法或抗血清鑒定法，經(jīng)病毒檢測后，確認是不帶病毒的株系，才能進(jìn)一步利用，對繼續帶病毒的株系應淘汰或進(jìn)行再次脫毒。
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