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逆轉錄病毒載體

逆轉錄病毒的許多特點(diǎn)使其成為基因轉移載體的最佳選擇。它可有效的整合入靶細胞基因組并穩定持久地表達所帶的外源基因。病毒基因組以轉座的方式整合,其基因組不會(huì )發(fā)生重排,因此所攜帶的外源基因也不會(huì )改變。逆轉錄病毒屬RNA病毒,通過(guò)其本身逆轉錄酶的作用,形成雙鏈DNA原病毒,然后整合于宿主細胞染色體中。

逆轉錄病毒是一類(lèi)正鏈RNA病毒,其分為順式功能基因和反式功能基因。由于逆轉錄病毒包膜上有env 編碼的糖蛋白能被許多哺乳動(dòng)物細胞膜上特異性受體所識別,并能介導逆轉錄病毒的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入宿主細胞內;同時(shí)逆轉錄病毒結構基因gag、 env 和pol的缺乏不影響其他部分的活性,因此可用外源性基因代替這部分病毒基因,外源性基因最大容量為8.0kb左右,可適用于大部分目的基因;并且病毒在自身表達的整合酶催化作用下可高效地整合入宿主細胞染色體中,這有利于外源基因在宿主細胞的永久表達。構建載體時(shí)以DNA原病毒為基礎,將野生型病毒的3類(lèi)結構基因gag,polenv刪除,以供外源基因的插入,但是要保存病毒的包裝序列(ψ)和雙側的長(cháng)末端重復(LTR),LTR含有啟動(dòng)子、增強子、整合信號及poly A信號等多種元件。插入的基因一般為兩種或兩種以上,如目的基因和標記基因。因此和逆轉錄病毒結合的是DNA。

將目的基因重組到逆轉錄病毒載體上,制成高濃度的病毒顆粒,人為感染著(zhù)床前或著(zhù)床后的胚胎,也可以直接將胚胎與能釋放逆轉錄病毒的單層培養細胞共孵育以達到感染的目的,通過(guò)病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中去。通過(guò)此方法,得到了轉基因雞和轉基因牛。

    這種逆轉錄病毒被用重組DNA技術(shù)修飾后作為基因載體在應用中優(yōu)于微注射法之處為:無(wú)需要重排,可在整合點(diǎn)整合轉移基因的單個(gè)拷貝;將胚胎置于高濃度病毒容器中,或者與被感染的細胞體外共同培養,或微注射雞胚盤(pán)里,整合有逆轉錄病毒的DNA的胚胎率高。缺點(diǎn)是:需要生產(chǎn)帶有轉基因的逆轉錄病毒;插入逆轉錄病毒的基因有一定的大小限度;所得轉基因家畜的嵌合性很高,而需要廣泛的雜交,以建立轉基因系;轉基因的表達問(wèn)題尚未解決。

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