人伦人妻中文字幕无码_ RIP實(shí)驗（RNA結合蛋白免疫沉淀）

RIP技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結合蛋白免疫沉淀），是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術(shù)。分析與目的蛋白結合的RNA.運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來(lái)，然后經(jīng)過(guò)分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進(jìn)行分析；即用抗體或表位標記物捕獲細胞核內或細胞質(zhì)中內源性的RNA結合蛋白，防止非特異性的RNA的結合，免疫沉淀把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來(lái)，結合的RNA序列可通過(guò)microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量測序（RIP-Seq）方法來(lái)鑒定。是了解轉錄后調控網(wǎng)絡(luò )動(dòng)態(tài)過(guò)程的有力工具，能幫助我們發(fā)現miRNA的調節靶點(diǎn)。

一、實(shí)驗流程圖

二、RIP實(shí)驗流程
（一）. 細胞裂解液獲取
A. 單層細胞或者貼壁細胞處理
1. 冷PBS清洗培養皿或培養瓶中的細胞兩次
2. 加入冷PBS后用細胞刮將細胞刮下來(lái)，收集至enpendoff管
3. 1500rpm，4℃離心5min，棄上清，收集細胞
4. 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞，吹打均勻后于冰上靜置5min
5. 每管分裝200ul細胞裂解液，貯存于-80℃
B. 懸浮細胞處理：先收集細胞再計數，然后清洗裂解
C. 組織樣品處理
1.冷PBS清洗新鮮切下的組織三次
2. 加入冷PBS后，用勻漿器或其他細胞分離設備使組織分散為單個(gè)細胞，計數
3. 1500rpm，4℃離心5min，棄上清，收集細胞
4. 用與細胞等體積的RIP裂解液重懸細胞，吹打均勻后置于冰上靜置5min
5. 每管分裝200ul細胞裂解液，貯存于-80℃
（二）. 磁珠的準備
A. 實(shí)驗前準備
1、enpendoff管
2、磁力架
3、冰盒， RIP Wash Buffer置于冰上
4、抗體，置于冰上
5、渦旋震蕩器
6、槍、槍頭放于超凈臺照射30min，槍噴DEPC水
B. 磁珠準備過(guò)程
1. 重懸磁珠
2. 標記實(shí)驗所需的enpendoff管，樣品包括目的樣品，陰性對照與陽(yáng)性對照
3. 吸取50ul 重懸后的磁珠懸液于每個(gè)enpendoff管
4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer，渦旋震蕩
5.將enpendoff管置于磁力架上，并左右轉動(dòng)15°使磁珠吸附成一條直線(xiàn)，去上清，重復一次
6.用100ul的RIP Wash Buffer重懸磁珠，加入約5ug相應抗體于每個(gè)樣品中
7. 室溫孵育30min
8. 將enpendoff管置于磁力架上，棄上清
9. 加入500ul RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后棄上清，重復一次
10. 加入500ul RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后置于冰上
（三）. RNA結合蛋白免疫沉淀
A. 準備工作
1、冰盒
2、360°旋轉儀
3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上
B. RNA結合蛋白免疫沉淀實(shí)驗過(guò)程
1.準備RIP Immunoprecipitation Buffer
2.將前上步的enpendoff管放磁力架上，去上清，每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
3. 迅速解凍第一步制備的細胞裂解液，14,000rpm，4℃離心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗體復合物中，使得總體積為1ml
4. 4℃孵育3h至過(guò)夜
5. 短暫離心，將enpendoff管放在磁力架上，棄上清
6. 加入500ul RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后將enpendoff管放在磁力架上，棄上清，重復清洗6次
（四）. RNA純化
A. 實(shí)驗前準備
1.槍、槍頭、enpendoff管紫外照射30min，噴DEPC水以除RNA酶
2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上
3.RNase-free的乙醇、氯仿、異戊醇
4.DEPC水置于冰上
5. 離心機預冷
6. 冰盒
B. RNA純化過(guò)程
1.準備Proteinase K Buffer。每個(gè)樣品需150ul
2.用150ul Proteinase K Buffer重懸上述磁珠-抗體復合物
3. 55℃孵育30min
4. 孵育完之后，將enpendoff管置于磁力架上，將上清液吸入一新的enpendoff管中
5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer
6. 于每管加入400ul苯酚：氯仿：異戊醇，渦旋震蕩15s，室溫下14,000rpm離心10min
7. 小心的吸取350ul上層水相，吸入另一新的enpendoff管
8. 于每管加入400ul氯仿，渦旋震蕩15s，室溫下14,000rpm離心10min
9. 小心的吸取300ul上層水相，吸入另一新的enpendoff管
10. 每管加入50ul Salt SolutionⅠ，15ul Salt SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ，850ul 無(wú)水乙醇(無(wú)RNase)，混合，-80℃保持1h至過(guò)夜
11. 14,000rpm，4℃離心30min，小心去上清
12. 用80%乙醇沖洗一次，14,000rpm，4℃離心15min，小心去上清，空氣中晾干.
13. 10-20ul DEPC水溶解，-80℃保存，送測序或進(jìn)行下游實(shí)驗。

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