一.所用試劑
1.0.01MPBS緩沖液,PH7.4 ：高壓滅菌，40C保存。臨用前－200C放置30分鐘，確保冰冷。
2.焦碳酸二乙酯(DEPC)：sigma公司，40C保存。
3.0.1%DEPC處理的滅菌去離子水：100ml去離子水中加入0.1mlDEPC，劇烈振蕩混勻，讓DEPC充分進(jìn)入溶液中，370C放置過(guò)夜，高壓蒸汽滅菌30分鐘除去DEPC。40C保存。
4.單相細胞裂解試劑TRizoL：Invitrogen生命技術(shù)公司，40C保存。臨用前－200C放置30分鐘，確保冰冷。
5.氯仿：用新開(kāi)封的，10ml分裝，40C保存。臨用前－200C放置30分鐘，確保冰冷。
6.異丙醇：用新開(kāi)封的，20ml分裝，40C保存。臨用前－200C放置30分鐘，確保冰冷。
7.0.1%DEPC處理的75％乙醇：無(wú)水乙醇75ml加0.1%DEPC處理的滅菌去離子水至100ml，4C保存。臨用前－200C放置30分鐘，確保冰冷。
8.cDNA反轉錄試劑盒：MBI公司，－200C保存。
9.2xPCR試劑：MBI公司，－200C保存。
10.5xTBE RNA電泳緩沖液：因為T(mén)ris堿可與DEPC發(fā)生反應并使之失活，所以含Tris堿的電泳緩沖液可用DEPC處理的滅菌去離子水配制，0.22um濾器過(guò)濾除菌。室溫保存，臨用前用DEPC處理的滅菌去離子水10倍稀釋。使用本室RNA專(zhuān)用電泳槽，每次需配制0.5x電泳緩沖液500ml。
11.50xTAE DNA電泳緩沖液：室溫保存，臨用前用去離子水50倍稀釋。使用本室DNA專(zhuān)用電泳槽，每次需配制1x電泳緩沖液1000ml。
12.6x上樣緩沖液：1.5mlDEPC處理的滅菌離心管中稱(chēng)取2.5mg溴酚藍，加入0.3ml甘油，DEPC處理的滅菌去離子水定容至1ml，40C保存。
13.1.5％瓊脂糖：RNA電泳，1.5g瓊脂糖加入0.5xTBE RNA電泳緩沖液中;DNA電泳, 1.5g瓊脂糖加入1xTAE DNA電泳緩沖液中。微波爐煮沸熔化后，冷卻至600C左右，每100ml膠加入溴化乙啶(EB,10mg/ml)5ul。
14.溴化乙錠（10mg/ml）：在100ml水中加入1g溴化乙錠，磁力攪拌數小時(shí)以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉移至棕色瓶中，保存于室溫。
15.人淋巴細胞分離液：上海華精生化試劑廠(chǎng)。
二.總RNA提取
[注]1.本方法采用Chomczynski一步法，用單相細胞裂解試劑TRizoL破碎細胞和滅活細胞中內源性RNA酶同步進(jìn)行，可同時(shí)分離RNA、DNA和蛋白質(zhì)。TRizoL中含有酚、強變性劑硫氰酸狐和溶解劑等。本法所提取的RNA可用于RT-PCR、Northern印跡雜交等。
2.最好單獨存放用于RNA實(shí)驗的試劑，以防止污染。
3.耐高溫的勻漿器、研缽及研棒用錫箔紙包好，2000C干烤5小時(shí)，滅活外源性RNA酶。
4.離心管、槍頭等塑料制品用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液浸泡12小時(shí)以上滅活外源性RNA酶。再用去離子水浸泡10分鐘x3次，以去除DEPC，然后70-800C烤干，高壓蒸汽滅菌30分鐘除去殘留的DEPC，以防DEPC通過(guò)羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。
5.提取RNA所用的去離子水及配制試劑均要經(jīng)含0.1%DEPC處理。
6.如果是從完整包裝中新取出的塑料制品，一般無(wú)外源性RNA酶污染，可以直接使用。
7.實(shí)驗者的雙手是外源性RNA酶的重要污染源，因此務(wù)必戴手套進(jìn)行操作。
8.DEPC為可疑致癌物，且有芳香性揮發(fā)氣味，使用時(shí)應戴手套、口罩，并打開(kāi)排氣扇。
9.RNA紫外分光光度計定量所用石英比色皿使用后，在1：1鹽酸甲醇中浸泡30分鐘以上，再用0.1%DEPC處理去離子水沖洗干凈，涼干。
10.用于RNA電泳的電泳槽用去污劑清洗干凈，自來(lái)水沖洗數次，再用去離子水沖洗1次，無(wú)水乙醇擦洗，干燥。然后灌滿(mǎn)3％的雙氧水室溫放置10分鐘，最后用DEPC處理的去離子水沖洗3次。
11.提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，28S rRNA和18S rRNA應當能清楚地在紫外分析儀下看到，也應當能看到一條由tRNA, 5.8S rRNA和5S rRNA組成的，較模糊遷移較快的帶。如果RNA沒(méi)有被降解，28S rRNA的亮度應當是18S rRNA亮度的兩倍，且這兩條帶都沒(méi)有彌散現象。加樣孔附近有條帶表明產(chǎn)物中混有DNA。
(一).培養細胞中RNA提取
1.貼壁生長(cháng)的細胞：倒出培養液，加5ml無(wú)菌冰冷的PBS緩沖液沖洗細胞2次。倒出PBS緩沖液(盡量空干)，加入1mlTRizoL,用力振蕩培養瓶或培養皿(貼壁較牢固的細胞可用細胞刮刀刮取細胞)，使細胞完全脫落，用加樣器吹打均勻，吸入1.5ml離心管中，漩渦混勻器振蕩30秒，室溫靜置5分鐘，使核蛋白完全從核酸上解離。懸浮生長(cháng)的細胞：細胞懸液倒入10-15ml離心管，2000轉/分離心10分鐘收集細胞，倒出培養液，加2ml無(wú)菌冰冷的PBS緩沖液，混勻使細胞沉淀重懸洗滌細胞2次。再2000轉/分離心10分鐘收集細胞，倒出PBS緩沖液(盡量空干)，加入1mlTRizoL,用加樣器吹打均勻，吸入1.5ml離心管中，漩渦混勻器振蕩30秒，室溫靜置5分鐘，使核蛋白完全從核酸上解離。
2.加氯仿200ul,漩渦混勻器振蕩30秒，冰盒上靜置10分鐘，
3.高速冷凍離心機（溫度設定40C）12000/分離心15分鐘，使混合物分為兩相(RNA留在水相，DNA和蛋白質(zhì)被抽提進(jìn)氯仿層)，吸取上層水相0.5ml移至一個(gè)新的1.5ml離心管中，加異丙醇0.5ml。充分混勻，冰盒上靜置10分鐘，使RNA充分沉淀。
4.高速冷凍離心機（溫度設定40C）12000/分離心15分鐘,棄去上清液,加入冰冷75%乙醇1ml洗滌RNA沉淀,漩渦混勻器振蕩30秒.
5.高速冷凍離心機（溫度設定40C）8000/分離心5分鐘,棄去上清液,沉淀快速風(fēng)干。但不要完全干燥這一點(diǎn)非常重要，否則RNA沉淀溶解度會(huì )大大降低?？赏ㄟ^(guò)在55－600C加熱并用槍頭反復吹打溶液增加RNA的溶解度。
6.提取的RNA加適量DEPC處理去離子水溶解(組織及培養細胞所提RNA加水50－100ul外周血白細胞所提RNA加水10－15ul)。取5ul+1ul6x電泳上樣緩沖液點(diǎn)樣，電壓120-130V電泳30分鐘左右，如在紫外分析儀下可見(jiàn)5S、18S及28S三條帶出現，說(shuō)明已提出RNA。5S條帶較模糊遷移較快。如果RNA沒(méi)有被降解，28S rRNA的亮度應當是18S rRNA亮度的兩倍，且這兩條帶都沒(méi)有彌散現象。加樣孔附近有條帶表明產(chǎn)物中混有DNA。RNA純度鑒定及定量可用紫外分光光度計，取2ul＋148ul去離子水測A260nm/280nm，比值應在1.8-2.0之間。RNA濃度(ug/ml)=A260x稀釋倍數x40。對大多數細胞株來(lái)說(shuō)，一個(gè)100ml培養瓶中培養細胞的RNA收率為100－200ug。
7.如暫時(shí)不做反轉錄，,立即放-800C冰箱凍存。
貼壁細胞總RNA提取操作流程
I
細胞長(cháng)滿(mǎn)80%瓶底或皿底，換培養液，第二天提取RNA
(倒掉培養液，5-10ml冰PBS洗滌細胞2次空干)
加1ml冰TRizoL,用力振蕩培養瓶使細胞完全脫落，加樣器吹打
(吸入1.5ml離心管，旋渦振蕩10秒，室溫靜置5分鐘)
加氯仿200ul,漩渦混勻器振蕩10秒，冰盒上靜置10分鐘
(40C,8000rpm,5分鐘，)
吸取上層水相0.5-0.7ml移至另一1.5ml離心管中，加異丙醇0.5-0.7ml
(充分混勻，冰盒上靜置10分鐘，40C,12000rpm,15分)
棄上清,加75%冰乙醇1ml, 顛倒混勻數次
(40C,12000rpm,15分)
棄上清,沉淀快速風(fēng)干。但不要完全干燥, 加DEPC處理去離子水50-100ul
取5ul作RNA電泳，5ul作RNA定量，余-800C冰箱保存
(二).組織中RNA提取
1.組織收集：新鮮組織立即放入液氮中30分鐘以上后，可在-800C冰箱保存，數月內不會(huì )影響RNA的產(chǎn)量及質(zhì)量。
2.取組織50-100mg放入1ml玻璃勻漿器中，加入1mlTRizoL,在冰浴中研磨，懸液轉入1.5ml離心管中，室溫靜置5分鐘，使核蛋白完全從核酸上解離。高速冷凍離心機（溫度設定40C）12000/分離心5分鐘，上清液倒入另一1.5ml離心管中。
3.以下步驟同培養中細胞RNA提取法(2-7)。
(三)外周血白細胞RNA提取
1.抽取靜脈血5ml,注入0.5ml 3.8％枸櫞酸鈉（血液：抗凝劑＝10：1）的抗凝管中，加蓋顛倒混勻2-3次。
2.將上述抗凝血倒入15ml離心管中，加5mlPH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）等量稀釋。
3吸取5ml淋巴細胞分離液（上海華精生物技術(shù)公司生產(chǎn)）加入另一15ml離心管中。
4.將稀釋后的抗凝血10ml沿管壁緩慢加到淋巴細胞分離液上，水平離心機2000轉/分離心20分鐘。
5.吸取中間白細胞層至另一15ml離心管中，加入5mlPH7.4PBS緩沖液混勻（洗滌白細胞），4000轉/分離心5分鐘。棄去上清液，所得白色沉淀即為單個(gè)核細胞，如暫時(shí)不提取RNA,立即-800C冰箱凍存。
6.加入TRizoL(Invitrogen生命技術(shù)公司生產(chǎn))1ml,用加樣器吹打均勻，吸入1.5ml離心管中，漩渦混勻器振蕩30秒，室溫靜置5分鐘，使核蛋白完全從核酸上解離。
7.以下步驟同培養中細胞RNA提取法(2-7)。
三.反轉錄
參見(jiàn)不同廠(chǎng)家試劑盒說(shuō)明書(shū)，以本室使用的Fermentas MBI公司(#K1621)cDNA反轉錄兩步法試劑盒為例。一步法是將反轉錄及PCR反應的所有試劑加在一個(gè)反應體系(EP管)，缺點(diǎn)是試劑用量大，反應條件不好掌握；兩步法是先反轉錄，然后進(jìn)行PCR反應。
反轉錄反應
（1）在超凈臺中，取DEPC處理的200μlPCR管置冰上，依次加入
總RNA 1μg(2ul)
隨即引物(0.5μg/μl) 1μl
無(wú)RNA酶水 9ul至總體積12μl
混勻，用微量離心機離心3000轉/分30秒。
（2）置PCR儀上70℃5分鐘變性，取出置冰上冷卻。
（3）PCR管置冰上，依次加入
5×RT Buffer 4μl
RNase inhibitor(20U/μl) 1μl
10mM dNTP Mix 2μl
混勻，用微量離心機離心3000轉/分30秒。
（4）置PCR儀上25℃5分鐘。取出置冰上冷卻。
（5）加入M-MuLV逆轉錄酶（200U/μl）1μl至終體積20μl。
（6）置PCR儀上按以下條件進(jìn)行
25℃ 10分鐘
42℃ 60分鐘
70℃ 10分鐘
立即冰上冷卻，產(chǎn)物cDNA即用于PCR或置-20℃冰箱保存。
四.PCR反應
（1）取200μIPCR管依次加入
2×PCR Master Mix 12.5μl
cDNA 2.0μl
上游引物 1μl
下游引物 1μl
滅菌去離子水 8.5ul至25μl
用微量離心機離心3000轉/分30秒混勻。
（2）按以下條件進(jìn)行PCR反應：
94℃ 5分鐘 預變性
94℃ 30秒 變性
55-60℃ 45秒 退火
72℃ 45秒 延伸，共30-35個(gè)循環(huán)
72℃ 7分鐘 最終延伸。
五.實(shí)驗對照
1.陽(yáng)性對照：采用已知高表達細胞的總RNA進(jìn)行逆轉錄和PCR擴增。
2.陰性對照：用滅菌去離子水代替總RNA的反應體系進(jìn)行逆轉錄和PCR擴增。
3.內參照：以引物進(jìn)行PCR反應的同時(shí)，以β-actin引物(或者GAPDH引物)進(jìn)行PCR反應。
六.瓊脂糖凝膠電泳
取內參照擴增產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物15ul+3ul 6x上樣緩沖液，同時(shí)用相應的5-8ul DNA Marker,2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓110-120V，30-45分鐘。
七.紫外分析儀觀(guān)察、數碼照相
于紫外透視儀下觀(guān)察有無(wú)特異性擴增帶，并照相記錄。
β-actin擴增產(chǎn)物大小540bp，340 bp。
GAPDH擴增產(chǎn)物大小142bp。
1、載玻片的處理：
抗原修復過(guò)程中，由于高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進(jìn)行，可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑，對已清洗的載玻片進(jìn)行處理。具體方法如下：
1.1 APES：現用現配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時(shí)應注意組織要一步到位，并盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。
1.2 HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2分鐘，然后用雙蒸水快速清洗三次，室溫干燥或60oC烤箱烘烤一小時(shí)，裝盒備用。
1.3 Poly-L-Lysine：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴(lài)氨酸溶液中，浸泡5分鐘，60oC烤箱烘烤一小時(shí)或室溫過(guò)夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。
2、常用酶消化：
2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時(shí)間為37℃、10~40分鐘，主要用于細胞內抗原的顯示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時(shí)間為37℃、30~180分鐘，主要用于細胞間質(zhì)抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。
2.3 g/ml的saponin溶液，消化時(shí)間為室溫孵育30分鐘。?皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10
3、抗原熱修復：
可根據實(shí)驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復?？乖瓱嵝迯涂蛇x用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實(shí)驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064 ?枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配制，取該粉劑一包溶于1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。
3.1 石蠟切片微波爐抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，3％H2O2處理10分鐘，蒸餾水洗2分鐘×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間并持續10~15分鐘（注意：無(wú)論是使用醫用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務(wù)必滿(mǎn)足以上步驟中對溫度和時(shí)間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鐘（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。
3.2 石蠟切片高壓抗原修復操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上，放入鍋內，使切片位于液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開(kāi)始慢慢噴氣時(shí)（約加熱5~6分鐘后），計時(shí)1~2分鐘，然后將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫后，取下氣閥，打開(kāi)鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗后，PBS洗2分鐘×3，下接免疫組化染色步驟。
3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法：切片脫蠟至水后，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，并將此容器置于盛有一定數量自來(lái)水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開(kāi)始計時(shí)15~20分鐘，然后端離電爐，室溫冷卻20~30分鐘，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。
4、免疫組化染色步驟：
（以美國ZYMED公司SP試劑盒為例）
石蠟切片脫蠟至水。
3%H2O2室溫孵育5~10分鐘，以消除內源性過(guò)氧化物酶的活性。
蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，(如需采用抗原修復，可在此步后進(jìn)行)。
5~10％正常山羊血清（PBS稀釋?zhuān)┓忾]，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時(shí)或4℃過(guò)夜(兩次溫箱1小時(shí)，效果都很差。這次用4度過(guò)夜看看)。
PBS沖洗，5分鐘×3次。
滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋?zhuān)?7℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。
PBS沖洗，5分鐘×3次。
滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋?zhuān)?7℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30分鐘。
PBS沖洗，5分鐘×3次。
顯色劑顯色（DAB或AEC）。
自來(lái)水充分沖洗，復染，封片。
冰凍切片免疫組化染色步驟
m，室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，PBS洗，5分鐘×3。用3％過(guò)氧化氫孵育5~10分鐘，消除內源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS洗，5分鐘×2。?冰凍切片4~8
下接免疫組化染色操作步驟。
一.所需儀器設備
1.電泳儀
2.垂直電泳槽
3.轉移電泳槽:濕轉或半干轉電泳槽
4.硝酸纖維素膜(NC膜)
5.暗盒
6.5x7cm X膠片
[注：電泳槽、玻璃板、梳子及膠條的清洗：自來(lái)水沖洗數次――去離子水沖洗數次2次――37C烤干備用。]
二.所用試劑
[注：配制及稀釋試劑均用去離子水，實(shí)驗器皿自來(lái)水清洗完畢再用去離子水沖洗]
1.Lysis buffer：RIPA 三去污劑裂解緩沖液
50mM Tris.Hcl 3.03g
150mM NaCl 生理鹽水 4.35g
0.02%NaN3（防腐劑，可以不加） 0.1g
0.1%SDS 強陰離子去污劑 0.5g
1% NP-40 去污劑 5ml
0.5% Sodium deoxycholate 去氧膽酸鈉 去污劑 2.5g
配制500ml,10M鹽酸調PH8.0, 4度保存。
使用前按1：50加入100mM PMSF(苯甲基磺酰氟，平時(shí)放-20度)和protease inhibitor(先溶在2ML水中，分裝在小管中，保存在-20度)，配好后馬上使用。也可分裝成(RIPA300ul+6ul100mM PMSF+6ulprotease inhibitor)(培養細胞及微小組織蛋白提取)若干管，-20度保存；分裝成(RIPA1000ul+20ul100mM PMSF+20ulprotease inhibitor)(較大組織蛋白提取)若干管，-20度保存。
[注：也可使用單去污劑裂解緩沖液，將1% NP-40換為1%Triton X-100。去掉0.1%SDS及0.5% Sodium deoxycholate 去氧膽酸鈉]
PMSF儲存液 100mM(17.4mg/ml)，溶于異丙醇。有效濃度100ug/ml。
2.150mM Nacl(0.87%Nacl,生理鹽水)
3.0.1mg/mL考馬斯亮蘭G-250溶液 蛋白定量用。用50ml 95%乙醇溶解100mg考馬斯亮蘭G-250,再加入100ml 85%磷酸，加水至1000ml。用Whatman濾紙過(guò)濾后，置棕色瓶4度保存。蛋白定量比色皿可用95%乙醇脫色。
4.考馬斯亮蘭脫色液 含50%甲醇、10%冰醋酸、40%去離子水。
5. 0.25%考馬斯亮蘭R-250溶液 染色用。100ml脫色液中加入0.25g考馬斯亮蘭R-250。
6.10mg/mlBSA，稱(chēng)取100mg小牛血清白蛋白溶于10ml滅菌去離子水中。置-20度冰箱保存。
7.1mol/L Tris-Hcl緩沖液,PH6.8
8.1.5 mol/L Tris-Hcl緩沖液,PH8.8
9.10% AP：過(guò)硫酸銨(Ammonium Persulfate,AP),Amresco分裝，為促凝劑,現配現用，準確稱(chēng)取AP 20mg于0.5ml離心管內(注：稱(chēng)量時(shí)可分裝數管室溫保存備用)臨用前加去離子水200ul溶解。配制好的AP溶液4C可保存1周。
10.TEMED,Amresco分裝，100ml包裝，為促凝劑,準確吸取TEMED 10ul于0.2ml離心管內,可分裝數管室溫保存備用。
11.10% SDS 在90ml去離子水中溶解10g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調節溶液的pH值至7.2，加入去離子水定容至100ml，室溫保存。
12.30% Acr 將29g丙烯酰胺和1gN,N’－亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中，加熱至37℃溶解之，補加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器(0.45孔徑)過(guò)濾除菌查證該溶液的pH值應不大于7.0，置棕色瓶中4度保存。
13.6xLoading buffer：6倍sample buffer
300mM tris.Hcl pH=6.8 ， 12% SDS ，0.6% bromophenol blue (溴酚藍)，60%Glycerol,甘油
Filted，分裝在1ml tube, 每毫升加43ul B-ME（β－巰基乙醇，還原劑），-20度保存。
14.蛋白Marker： 選擇最適分子量Marker(MBI公司蛋白Marker很好)
15.內參：可選擇最適分子量?jì)葏⒆?:3000-5000稀釋?zhuān)鏐-Actin(45KD，漿蛋白用)、GAPDH(36KD，漿蛋白用，上?？党缮锝?jīng)銷(xiāo))、B-Tubulin(核蛋白用)等。
16.1xTris-Glycine電泳緩沖液(PH8.3)
25mM tris,192mM Glycine, 0.1%(w/v)SDS,
500ml配方如下
Tris1.515g, glycine7.2g, SDS0.5g用去離子水加至500ml。加10M HCl約800ul，就可以調至pH8.3。
17.1xTransfer buffer(PH8.3)
25mM tris, 192mM Glycine, 20%Methanol（甲醇），ph為8.3
500ml配方如下
Tris 1.515g,glycine7.2g,100ml Methanol（甲醇），用去離子水加至500ml。加10M HCl約550ul，就可以調至pH8.3。
18. TBST Washing buffer：
50mM tris, 150mM Nacl, 0.1% Tween-20
1L配方如下
Tris 6.06g,NaCl8.7g,1mlTween-20,加入去離子水至1L，同時(shí)精確調準pH值為7.6。加10M HCl約4200ul，就可以調至7.6。Tween-20要在用前現加，未加Tween-20的稱(chēng)為T(mén)BS緩沖液。
19.5%的脫脂奶粉封閉液 用TBST Washing buffer配制。
20.一抗：santa原裝或北京中山分裝,一般做1:200-300稀釋。
21.HRP標記二抗：一般做1:3000-5000稀釋。二抗選擇原則如下：
如一抗為鼠抗人IgG, 二抗選擇羊抗(或兔抗)鼠HRP；
如一抗為羊抗人IgG, 二抗選擇鼠抗(或兔抗)羊HRP；
如一抗為兔抗人IgG, 二抗選擇羊抗(或鼠抗)兔HRP。
22.ECL化學(xué)發(fā)光顯色劑，或DAB顯色劑
三.總蛋白質(zhì)提取
1．培養細胞
1.1貼壁細胞數目達到培養皿(或培養瓶)底面積80－90%，最好前一天換上新的培養液。
1.2將培養液吸凈，用5ml左右4度PBS洗三次細胞平皿(洗凈培養液中的胎牛血清等外源性蛋白)，將PBS吸凈，加入triple-detergent lysis buffer，100mm培養皿加300ul。(蛋白質(zhì)種類(lèi)不同—漿蛋白、核蛋白、膜蛋白，細胞裂解液有所不同)如暫時(shí)不提取，可將培養皿-80度保存。
1.3輕輕的轉動(dòng)培養皿直到細胞被溶解下來(lái)，細胞刮輕輕刮下裂解物，并可見(jiàn)白色的核酸(DNA、RNA)沉淀，（約1分鐘）將所有的液體包括沉淀，吸入1.5ml離心管，旋渦混勻器30秒，放在冰上10分鐘使細胞充分裂解，然后，用4度離心機12000轉10分鐘。
1.4留10ul上清液做蛋白定量外，其余上清于另一1.5ml離心管(將蛋白樣品5份+1份6×loading buffe，6×loading buffe加入前用80度左右的水預熱一下，使其溶解充分。把樣品在100度的沸水中煮5分鐘使蛋白變性，離心管上標明蛋白含量，保存在-80度冰箱)
2.組織中蛋白提取
2.1特小的組織加300ulLysis buffer玻璃勻漿器中，冰浴中研磨數次，勻漿上清液吸入1.5ml離心管中，然后，用4度離心機12000轉10分鐘。吸取上清于另一1.5ml離心管，分裝，保存在-80度冰箱。留10ul上清液做蛋白定量。
2.2取50－100mg組織放入玻璃勻漿器中，加3倍體積Lysis buffer，冰浴中研磨數次，勻漿上清液吸入1.5ml離心管中，然后，用4度離心機12000轉10分鐘。吸取上清于另一1.5ml離心管，分裝，保存在-80度冰箱。留10ul上清液做蛋白定量。
四.蛋白質(zhì)定量
1.應用標準的Bradford法定量。
2.待測樣本各10ul＋90ul生理鹽水；標準管中分別加入10mg/mlBSA 0ul、2.5ul、5.0ul、7.5ul、10ul, 每管加生理鹽水至100ul(蛋白含量分別為0、25、50、75、100ug)，同時(shí)以100ul的生理鹽水作空白對照。各管加入考馬斯亮藍染料溶液1900ul至總體積2ml，混勻，室溫放置2分鐘。比色檢測作標準曲線(xiàn)，計算出各個(gè)樣品的蛋白含量。
3.比色定量：通過(guò)OD值，來(lái)計算蛋白量。統計軟件計算出結果；
五.樣品準備
1.將已定量的蛋白樣品5份+1份6×loading buffe，6×loading buffe加入前用80度左右的水預熱一下，使其溶解充分。把樣品在100度的沸水中煮5分鐘， (水中煮沸5分鐘，目的是讓蛋白變性，由四級結構變成一級結構。注意事項：煮沸時(shí)，一定不要讓離心管口彈開(kāi)進(jìn)入水，要隨時(shí)觀(guān)察。)
2.一般來(lái)講蛋白上樣量30ug；計算出每個(gè)樣品30ug所用的體積，在樣品管上標記體積數值，以后直接吸取就行了。
3.等體積上樣：用事先準備好1×loading buffer，調成15ul相同體積。這樣條帶整齊。
六.蛋白電泳
1.分離膠制備
1.膠的選擇：膠的濃度越大，所能分離蛋白的分子量越小。（阿恒覺(jué)得這里一般還是10%到15%的比較常用）
7.5% :45—200KD
10%: 31----200KD
12%: 21.5---200KD
15%6.5---200KD
2.10ml 10%分離膠制備
去離子水 3950ul
30%Acr 3350ul
1.5MTris-Hcl,PH8.8 2500ul
10%SDS 100ul
混勻;依次快速加入10%AP 100ul及TEMED 4ul,充分混勻但不要產(chǎn)生氣泡。（這部很關(guān)鍵）
3.立即灌膠，不要產(chǎn)生氣泡，如有氣泡可用10ml注射器針頭排除。在每側膠板加膠至紅色塑料板的下緣處即可（差不多4－5ml）
4.沿玻璃板壁緩慢加去離子水1cm高度，隔絕空氣，分離膠室溫凝固2小時(shí)以上。也可4度冰箱過(guò)夜。
2.5%積層膠制備
(配制積層膠前先傾斜玻璃板，使上面水層匯聚于一邊，用10ml注射器吸取干凈，靜置10分鐘左右，使水分蒸發(fā)干凈)
2.1 4ml 5%積層膠制備
去離子水 2800ul
30%Acr 660ul
1MTris-Hcl,PH6.8 500ul
10%SDS 40ul
混勻;依次快速加入10%AP 40ul及TEMED 4ul,充分混勻但不要產(chǎn)生氣泡。立即灌膠，不要產(chǎn)生氣泡，如有氣泡可用10ml注射器針頭排除。
2.2插上梳子，積層膠室溫凝固30分鐘以上。小心撥出梳子，若膠孔有歪斜，則用注射器加以修正，吸出氣泡；（歪斜一般出現在基層膠凝固時(shí)間過(guò)短，或者配置比重過(guò)低，可用針頭撥亂反正之，但是難度很高，容易挑破）
2.3去掉膠條，加入甘氨酸電泳緩沖液，內外持平；
2.4清洗膠孔：去除沒(méi)有凝聚的Acr，并清除氣泡。
3.點(diǎn)樣：使用20ul的加樣槍?zhuān)捎?#8220;對側加樣法”加樣。
4.電泳
電泳在4度冰箱中進(jìn)行，積層膠90V，30分鐘左右，待溴酚蘭指示劑到達分離膠表面時(shí)改變電壓120-130V，2小時(shí)左右――此方法可以保持膠內受熱均勻，電流、電場(chǎng)均勻，條帶齊規整）
5.剝離膠：在平皿中，用手術(shù)刀片小心剝離，切掉積層膠，取出分離膠，用于下一步試驗。
七.轉膜
1.準備一大的玻璃培養皿，
2.Tansfer buffer：配制500ml（一部分倒于玻璃皿中，以分離膠－制作夾心餅）；取膠－修剪膠：取膠時(shí)手應錯開(kāi)分離玻璃，使膠取出，去掉積層膠部分，修剪周邊使其與預先制作好的硝酸膜大小一致，約長(cháng)8cm、高5cm左右，NC膜用剪刀在一個(gè)角剪一個(gè)標記；制作夾心餅：黑負白正，從近負極面依次為“黑夾板＝海棉－濾紙（5層）－膠－膜－濾紙（5層）－海棉＝白夾板”形象“漢堡”或“夾心餅”；用玻璃棒趕盡氣泡]（這步要一層層的趕氣泡，氣泡非常影響轉膜結果）
3. Transfer time
4度6-12小時(shí)（4C轉膜過(guò)夜，時(shí)間根據分子量的大小調整，大分子可以12小時(shí)，小的6小時(shí)左右）
4.將膜取下，用去離子水洗。
八.Western blot
blot之前可以用麗春紅（ponceaus）染NC膜，以觀(guān)察蛋白轉膜情況（是否完全、條帶是否齊）。然后用自來(lái)水或washing buffer洗掉麗春紅后進(jìn)行印跡?？梢耘軆蓧K膠，一塊blot，一塊染色觀(guān)察。（其實(shí)，恩，染過(guò)色的膠洗掉還是可以用的，吼吼?。?
步驟：
1.裁膜：根據電泳后蛋白Marker的位置，裁剪所需目的蛋白、內參對應的膜。
2.封閉抗體：將膜放入自制blot袋；封閉液用5％的美國脫脂奶粉（用TBST wash buffer配制），blot with milk for 1h RT，也可4度過(guò)夜。（這個(gè)做袋袋，也是很有意思地 = = 哈哈?。?
3.加一抗：blot in primary antibody for 1.5h RT（抗體用milk稀釋?zhuān)?
4.洗膜：wash with TBST wash buffer 5times, each time 3mins
5.加二抗：blot in secondary antibody 1h RT （抗體用milk稀釋?zhuān)?
6.洗膜：wash with TBST wash buffer 5times, each time 3mins
九ECL顯色
1.加ECL試劑10ml于100mm玻璃培養皿中，再加30%雙氧水6ul(帶上手套，防止腐蝕皮膚)（萬(wàn)一腐蝕了，皮膚變成白色的，又疼又養，這是一個(gè)比偶倒霉的哥哥告訴偶的）,搖勻。
2.用濾紙吸干NC膜上水分，將膜放入ECL顯色液中顯色，肉眼看到條帶后，就可以取出，顯色強的約幾秒鐘，顯色弱的時(shí)間長(cháng)些，但是不可以超過(guò)3分鐘。
十.放射自顯影,沖洗膠片
1.放射自顯影操作在暗室進(jìn)行。紅色燈光下可避免底片曝光。切忌底片濕水。
2.用濾紙吸干膜上ECL顯色液,先將膜放入暗盒內，再放X膠片，根據目的條帶ECL顯色的強弱決定曝光時(shí)間。 （伸手不見(jiàn)5指的曝光，經(jīng)常大眼瞪小眼的看條帶）
3.目的條帶ECL顯色肉眼可以看到的話(huà)，說(shuō)明比較強，曝光時(shí)間可以短些，“3分鐘、5分鐘各一張＋必不可以少的10分鐘一張”；肉眼看不見(jiàn)，曝光時(shí)間可以長(cháng)些，“不可以少的10分鐘，15分鐘、30分鐘各一張”。
4.一般來(lái)說(shuō)，曝光三張已足夠用。（偶一口氣爆上6張，左眼看3張，右眼看3張，嘿嘿~~）
5.放射科沖洗X膠片，讀片。
6.X膠片掃描保存。
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