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豬腸道微生物樣品的采集與核酸提取
Preparation and Nucleotide Extraction of Samples from the Pig Digestive Tract
伍師哲1，劉沫言1，宋慶慶1，成艷芬2，朱偉云2，戴兆來(lái)1,2, *
1動(dòng)物營(yíng)養國家重點(diǎn)實(shí)驗室，中國農業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京；2動(dòng)物消化道營(yíng)養國際聯(lián)合研究中心，南京農業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京，江蘇省
*通訊作者郵箱: daizhaolai@cau.edu.cn
摘要:豬是中國消費量最大的肉用經(jīng)濟動(dòng)物也是消化生理和人類(lèi)最接近的模式動(dòng)物。研究豬消化道微生物區系的結構與功能對人類(lèi)的健康有重要意義。本文介紹了來(lái)源于豬腸道不同部位的微生物樣品（包括腸道內容物、腸黏膜微生物以及糞樣）的采集處理方法以及核酸提取方法。同時(shí)對實(shí)驗操作過(guò)程中的注意事項及方法的應用做了討論。本文所介紹方法同時(shí)適用于具有相似消化道結構與生理的單胃動(dòng)物。
關(guān)鍵詞: 腸道微生物，豬，樣品采集，核酸提取
材料與試劑
1.試驗動(dòng)物：商品豬或土種豬（根據實(shí)驗目的確定性別、日齡、日糧）
2.滅菌棉拭子
3.一次性無(wú)菌橡膠手套
4.滅菌紗布
5.滅菌手術(shù)剪和手術(shù)刀
6.滅菌手術(shù)縫合線(xiàn)
7.槍頭：10 μL、200 μL、1000 μL
8.移液管：5 mL、10 mL
9.離心管：1.5 mL、2 mL、50 mL
10.玻璃珠：3-4 mm
11.鋯珠：0.1 mm直徑（Biospec，目錄號：11079101z）
12.微生物總DNA提取試劑盒：QIAamp Fast DNA Stool Mini（QIAGEN，目錄號：51604）
13.微生物RNA保護試劑：RNAprotect Bacteria Reagent （QIAGEN，目錄號：76506）
14.微生物總RNA提取試劑盒：RNeasy Mini Kit（QIAGEN，目錄號：74104）
15.第一鏈反轉錄試劑盒：SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix kit（Thermo Fisher，目錄號：18080400）
16.0.2%吐溫80生理鹽水（見(jiàn)溶液配方）
17.DEPC水（無(wú)RNase水；見(jiàn)溶液配方）
18.75%乙醇
19.TE緩沖液（上海生工生物工程，目錄號：B548106）
20.Tris飽和酚溶液（pH 7.9±0.2；上海生工生物工程，目錄號：A504193）
21.氯仿-異戊醇（24:1，v/v）
22.水飽和酚溶液（上海生工生物工程，目錄號：A504195）
23.95%乙醇（見(jiàn)溶液配方）
24.70%乙醇（見(jiàn)溶液配方）
25.3 M乙酸鈉溶液（見(jiàn)溶液配方）
26.磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4；見(jiàn)溶液配方）
儀器設備
1.移液器（Eppendorf，型號：2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL）
2.電動(dòng)助吸器（Eppendorf，型號：5-50 mL）
3.高壓蒸汽滅菌鍋（Sanyo，型號：MLS-3750）
4.離心機（Eppendorf，型號：5810 R）
5.超純水系統（Sartoris，型號：Arium Pro VF）
6.生物樣品均質(zhì)器（OMINI，型號：Bead Ruptor 12）
7.渦旋混勻儀（Scientific Industries，型號：SI Vortex Genie 2）
8.冷藏冷凍冰箱（西門(mén)子，型號：BCD-610W）
9.超低溫冰箱（Thermo，型號：MLT）
10.PCR 儀（Bio-rad，型號：DNAengine）
實(shí)驗步驟
1.豬糞便樣品的采集
注：無(wú)論豬的日齡大小，保定與采樣過(guò)程均需考慮到豬只的舒適。對體重小于15 kg的仔豬而言，可采取人工保定，一人抱住仔豬，一人采樣的方式。對生長(cháng)豬和育肥豬而言，可采用限位欄固定豬只進(jìn)行采樣，成年種公豬和種母豬采用類(lèi)似采樣方法。采樣一般在進(jìn)食后的1 h-3 h進(jìn)行。涉及的動(dòng)物實(shí)驗需要在所屬的實(shí)驗動(dòng)物機構的指導下規范開(kāi)展。
1.1仔豬糞樣的采集
1.1.1.采樣前，用滅菌紗布分別蘸取生理鹽水和75%乙醇對保定好的仔豬的肛周進(jìn)行清洗，重復交替三次。
1.1.2.用滅菌的棉拭子蘸取滅菌的PBS對肛門(mén)進(jìn)行清洗，用新的蘸取PBS的棉拭子刺激肛門(mén)排便，并準備無(wú)菌50 mL離心管收集排出的糞便。
1.1.3.如無(wú)糞便排出，可用蘸取PBS的滅菌棉拭子緩慢伸入肛門(mén)內輕柔攪動(dòng)，使棉拭子沾染上存留在直腸中的糞便。
1.1.4.用滅菌棉拭子挑取少量收集于50 mL離心管中的糞樣轉移至帶有螺口蓋的2 mL滅菌離心管中，并用滅菌剪刀剪斷棉拭子連同棉球保存。對1.1.3步驟中的棉拭子，直接用滅菌剪刀截取帶有糞樣的棉球保存至帶有螺口蓋的2 mL滅菌離心管中。采集的樣品應在干冰或液氮中暫存，并保存于-80 °C冰箱中，用于核酸提取。
1.2生長(cháng)豬和育肥豬糞便樣品的采集
1.2.1.采樣前，用滅菌紗布分別蘸取生理鹽水和75%乙醇對保定好的豬只的肛周和肛門(mén)進(jìn)行清洗，重復交替三次。
1.2.2.采樣者戴無(wú)菌橡膠手套用滅菌PBS潤濕，用食指和中指緩慢伸入肛門(mén)內刺激直腸排便或直接收集糞便，將糞便樣品暫存于無(wú)菌50 mL離心管中。
1.2.3.用滅菌棉拭子挑取少量收集于50 mL離心管中的糞樣轉移至帶有螺口蓋的2 mL滅菌離心管中，并用滅菌剪刀剪斷棉拭子連同棉球保存。采集的樣品應在干冰或液氮中暫存，并保存于-80 °C冰箱，用于核酸提取。
2.豬腸道內容物樣品及腸黏膜微生物樣品的采集
注：為了獲得足夠多的腸道內容物用于實(shí)驗，可在進(jìn)食后的1 h-3 h采集腸道內容物及腸黏膜微生物樣品。
2.1屠宰采樣
2.1.1.豬只的處死：豬只頸部注射戊巴比妥鈉（20 mg/kg）麻醉后，采取頸靜脈放血致死。
2.1.2.迅速打開(kāi)腹腔，分離各腸段。為了防止腸道內容物在腸道內的流動(dòng)，用滅菌手術(shù)縫合線(xiàn)對各腸段進(jìn)行結扎。
2.1.3.前腸內容物樣品的采集
1)胃內容物的采集：結扎賁門(mén)部和幽門(mén)部，取出胃，打開(kāi)幽門(mén)部，輕柔擠出適量（> 30 mL）胃內容物于50 mL無(wú)菌離心管中，冰中保存并在最短時(shí)間內處理。
2)小腸食糜的收集：十二指腸相對較短，大多數實(shí)驗收集空腸和回腸食糜用于研究。定位空腸中段和回腸中段，用手術(shù)縫合線(xiàn)分別結扎兩腸段30 cm，分離腸系膜后，將其從腹腔取出。打開(kāi)一端收集適量（> 10 mL）食糜于50 mL無(wú)菌離心管中，冰中保存并在最短時(shí)間內處理。
3)前腸內容物樣品中微生物的富集（此部為可選步驟）：對胃內容物及水分含量較高的小腸食糜可進(jìn)行此操作。將等體積的樣品和滅菌的0.2%吐溫80生理鹽水溶液在50 mL離心管中（含有20粒滅菌玻璃珠）劇烈振蕩1 min，100 x g離心5 min，轉移全部上清至新的離心管中4 °C 13 000 x g離心10 min，收集沉淀于1.5 mL無(wú)菌離心管中，于-80 °C保存，用于核酸提取。
2.1.4.后腸內容物樣品的采集
1)根據實(shí)驗目的不同，選取盲腸中段和結腸中段，無(wú)菌采集內容物于2 mL滅菌離心管中，并迅速保存于液氮或干冰中，運回實(shí)驗室，于-80 °C保存，用于核酸提取。
2.1.5.腸黏膜微生物樣品的采集[1][2]
1)選取不同豬個(gè)體的胃腸的相對固定部位（如，胃底腺部、十二指腸全長(cháng)、其他腸段中間部位前后5 cm）進(jìn)行采樣，用手術(shù)剪刀打開(kāi)腸管，用尺測量取樣組織的長(cháng)度和寬度并記錄數據。
2)在培養皿中用冷的無(wú)菌PBS充分沖洗腸段的黏膜側和漿膜側，剪成小塊至于含有滅菌玻璃珠和0.1%吐溫80生理鹽水溶液（0.2%吐溫80生理鹽水溶液和等體積生理鹽水混合）的容器中，劇烈振蕩1 min。
3)取出腸道組織，轉移潤洗液于滅菌離心管中，4 °C 13 000 x g離心10 min，收集沉淀于1.5 mL無(wú)菌離心管中，于-80 °C保存，用于核酸提取。
2.2經(jīng)腸道瘺管采集腸道內容物樣品
2.2.1.采樣前，用75%乙醇浸濕的滅菌紗布對裸露體表的瘺管及瘺管周?chē)つw進(jìn)行擦拭消毒，重復三次。
2.2.2.采樣者佩戴一次性無(wú)菌橡膠手套，擰開(kāi)瘺管蓋，取出內塞，將無(wú)菌樣品收集袋固定在瘺管上，觀(guān)察食糜流出的量和狀態(tài)。
2.2.3.當袋內收集的食糜超過(guò)約50 mL時(shí)，更換收集袋，收集新的食糜，將收集袋中的食糜轉移至50 mL滅菌離心管中，保存至干冰中并在最短時(shí)間內運回實(shí)驗室處理。
注：屠宰采樣和腸瘺管采樣各有利弊。屠宰采樣可以同時(shí)研究不同腸段和不同部位的微生物變化，但不能考察同一豬只的腸道微生物的時(shí)間變化規律；腸瘺管采樣可研究特定腸段微生物的組成與代謝的時(shí)間變化規律，但無(wú)法研究不同腸段和部位的微生物的變化規律。
3.豬糞樣和腸道微生物樣品的核酸提取
注：收集的糞樣和腸道微生物樣品應在最短時(shí)間內進(jìn)行核酸的提取。
3.1.DNA的提取[3][4][5]
3.1.1.使用酚-氯仿-異戊醇法提取豬腸道內容物DNA
1)在1.5 mL離心管中無(wú)菌稱(chēng)取內容物樣品或離心獲得的微生物沉淀（0.3 g左右），記錄重量。
2)加入1 mL TE緩沖液吹打混勻轉移至含0.5 g滅菌鋯珠的 2 mL滅菌螺口離心管中，加入150 μLTris飽和酚。
3)在生物樣品均質(zhì)器中渦旋震蕩20 s/次，連續5次，每次冰上冷卻間隔1 min，加入150 μL氯仿-異戊醇（24:1），震蕩混勻20 s，13 000 x g離心5 min。
4)取上清于1.5 mL 離心管中，加入150 μL氯仿-異戊醇和150 μL水飽和酚，震蕩混勻1 min，13 000 x g離心5min，重復此步驟3到4次至蛋白層消失為止。
5)取上清于1.5 mL離心管中，加入300 μL氯仿-異戊醇，1 000 x g離心1 min，取上清于1.5 mL離心管中，加入1 mL 95%冷乙醇（-20 °C預冷過(guò)夜）和50 μL 3 M乙酸鈉溶液（pH = 5.2），-20 °C過(guò)夜沉淀DNA。
6)21 000 x g離心20 min，吸除上清后，加入1 mL 70%冷乙醇（-20 °C）溶解沉淀，21 000 x g離心5 min。吸除上清，風(fēng)干沉淀，加入50 μL TE緩沖液溶解DNA于-20 °C保存。
3.1.2.使用細菌基因組DNA提取試劑盒（QIAamp Fast DNA Stool Mini）提取豬腸道樣品總DNA。該方法中需用到鋯珠和溶菌酶對細菌細胞壁進(jìn)行破碎。
3.2.RNA提取與反轉錄
3.2.1.用 500 μL DEPC水重懸離心獲得的微生物沉淀或稱(chēng)取的腸道內容物樣品/糞樣。
3.2.2.轉移所有樣品于滅菌的不含RNase的2 mL 離心管中，加入1 mL RNAprotect Bacteria Reagent，渦旋混勻5 s，室溫孵育 5 min。
3.2.3.5 000 x g離心10 min，棄去上清，沉淀用于后續的消化和RNA提取。
3.2.4.用細菌RNA提取試劑盒（RNeasy Mini Kit）提取樣品中的RNA。
3.2.5.從提取的總RNA樣品中取1 μL測定濃度和純度。
3.2.6.檢測RNA的完整性：取2 μL總RNA用于1%瓊脂糖凝膠電泳（電壓120 V的條件下電泳30 min）,之后利用凝膠成像系統成像，檢測電泳條帶。
3.2.7.用第一鏈反轉錄試劑盒（SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix kit）對提取的RNA進(jìn)行反轉錄和后續操作。
溶液配方
1.0.2%吐溫80生理鹽水溶液
將2 g吐溫80溶解于1 L生理鹽水中，121 °C高壓滅菌20 min，冷卻至室溫備用。
2.DEPC水（無(wú)RNase水）
將1 mL DEPC溶于1 L去離子水中充分混合均勻，室溫放置過(guò)夜后，121°C高壓滅菌20 min使DEPC分解，冷卻至室溫備用。
3.95%乙醇
將950 mL無(wú)水乙醇與50 mL去離子水充分混勻，置于-20 °C保存備用。
4.70%冷乙醇
將700 mL無(wú)水乙醇與300 mL去離子水充分混勻，置于-20 °C保存備用。
5.3 M乙酸鈉溶液
稱(chēng)取40.8 g 三水合乙酸鈉（NaAc·3H2O）溶于約40 mL去離子水中攪拌均勻，用冰醋酸調節pH值至5.2，加去離子水定容至100 mL，121 °C高壓滅菌20 min，室溫保存備用。
6.磷酸鹽緩沖溶液（PBS；pH 7.4）
稱(chēng)取0.2 g KCl、8 g NaCl、0.2 g KH2PO4、1.44 g Na2HPO4，加入900 mL超純水溶解，將pH調節至7.2，定容至1 L，121 °C高壓滅菌20 min后室溫保存。
致謝
本實(shí)驗室的研究工作得到了國家“十三五”重點(diǎn)研發(fā)計劃（2017YFD0500501）、國家自然科學(xué)基金面上項目（32072689）、國家重點(diǎn)基礎研究計劃（2013CB127303）、國家自然科學(xué)基金青年基金（31301979）以及動(dòng)物消化道營(yíng)養國際聯(lián)合研究中心開(kāi)放課題的資助。
參考文獻
1.Gong, J., Forster, R. J., Yu, H., Chambers, J. R., Sabour, P. M., Wheatcroft, R. and Chen, S. (2002). Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the mucosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen. FEMS Microbiol Lett, 208(1), 1–7.
2.Yang, Y. X., Dai, Z. L. and Zhu, W. Y. (2014). Important impacts of intestinal bacteria on utilization of dietary amino acids in pigs. Amino acids, 46(11), 2489–2501.
3.Zoetendal, E. G., Heilig, H. G., Klaassens, E. S., Booijink, C. C., Kleerebezem, M., Smidt, H. and de Vos, W. M. (2006). Isolation of DNA from bacterial samples of the human gastrointestinal tract. Nat. Protoc., 1(2), 870–873.
4.Su, Y., Yao, W., Perez-Gutierrez, O. N., Smidt, H. and Zhu, W. Y. (2008). Changes in abundance of Lactobacillus spp. and Streptococcus suis in the stomach, jejunum and ileum of piglets after weaning. FEMS Microbiol Ecol, 66(3), 546–555.
5.Dai, Z. L., Zhang, J., Wu, G. and Zhu, W. Y. (2010). Utilization of amino acids by bacteria from the pig small intestine. Amino acids, 39(5), 1201–1215.
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