基本原理（點(diǎn)擊播放）
免疫印跡法（immunoblotting test，IBT）亦稱(chēng)酶聯(lián)免疫電轉移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因與Southen早先建立的檢測核酸的印跡方法Southen blot相類(lèi)似，亦被稱(chēng)為Western blot。免疫印跡（western blotting）是在蛋白質(zhì)電泳分離和抗原抗體檢測的基礎上發(fā)展起來(lái)一項檢測蛋白質(zhì)的技術(shù)。它將SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的高分辨力與抗原抗體反應的特異性相結合。
典型的印跡實(shí)驗包括三個(gè)步驟：
①蛋白質(zhì)的電泳分離
②將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉移至固體膜上，用非特異性，非反應活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質(zhì)區域
③免疫學(xué)檢測。免疫印跡克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳后直接在凝膠上進(jìn)行免疫學(xué)分析的弊端，極大地提高了其利用率、分辨率和靈敏度，使其成為使用最廣泛的免疫化學(xué)方法之一。
免疫印跡法原理示意圖
第一階段為SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）?？乖鹊鞍讟悠方?jīng)SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯酰酰凝膠中從陰極向陽(yáng)極泳動(dòng)，分子量越小，泳動(dòng)速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見(jiàn)（只有在染色后才顯出電泳區帶）。
第二階段為電轉移。將在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1～2A），通電45min轉移即可完成。此階段分離的蛋白質(zhì)條帶肉眼仍不可見(jiàn)。
第三階段為酶免疫定位。將印有蛋白質(zhì)條帶的硝酸纖維素膜（相當于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區帶染色。常用的HRP底物為3，3，—二氨基聯(lián)苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈藍紫色）。陽(yáng)性反應的條帶清晰可辨，并可根據SDS-PAGE時(shí)加入的分子量標準，確定各組分的分子量。
本法綜合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特異性和敏感性，是一個(gè)有效的分析手段，不僅廣泛應用于分析抗原組分及其免疫活性，并可用于疾病的診斷。在艾滋病病毒感染中此法作為確診試驗?？乖?jīng)電泳轉移在硝酸纖維素膜上后，將膜切成小條，配合酶標抗體及顯色底物制成的試劑盒可方便地在實(shí)驗室中供檢測用。根據出現顯色線(xiàn)條的位置可判斷有無(wú)針對病毒的特異性抗體。
樣本的制備
幾乎任何蛋白質(zhì)都可用于免疫印跡。免疫印跡的優(yōu)勢是能分析不能用其他的免疫化學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究的蛋白質(zhì)樣品。例如，不能標記的蛋白質(zhì)或不溶于溫和抽提緩沖液的蛋白質(zhì)等。免疫印跡還可分析各種組織、器官或微生物等來(lái)源的粗制樣品。
用于免疫印跡的樣本種類(lèi)繁多，處理的方法也有所不同，為了選擇理想的處理方法，應當考慮細胞的類(lèi)型和待測抗原的性質(zhì)。
細菌表達蛋白質(zhì)和樣本制備
一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解，具體方法如下：
[試劑與設備]
（1）表達待檢測蛋白質(zhì)的細菌。
（2）50mmoL／LTris-HCl（pH7.4）。
（3）2xSDS凝膠加樣緩沖液：
100mmol／L Tris—HCl（pH6.8）
200mmol／L 二硫蘇糖醇（DTT）
4％ SDS（電泳級）
0.2％ 溴酚藍
20％ 甘油
不含有二硫蘇糖醇（DTT）的2XSDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，臨用前須從1mol／L二硫蘇糖醇儲存液現用現加于上述緩沖液中。
（4）臺式離心機。
（5）超聲破碎儀。
（6）水浴箱。
（7）渦漩振蕩器。
（8）加樣器與吸頭等。
[操作步驟]
（1）表達靶蛋白大腸桿菌經(jīng)誘導適當時(shí)間后，用微量離心機以12 000g離心30s，收集1ml培養的菌體。
（2）吸取培養液，加入0.5ml用冰預冷的50mmol／LTris—HCl（pH7.4），振蕩沉淀的菌體，
使之復懸，用微量離心機于0°C以12000g離心30s回收菌體。
（3）再次吸出上清液，小心地吸凈管壁上的液滴，盡可能使沉淀物不帶有殘留液體。
（4）加入25μl水，振蕩使沉淀復懸，一旦菌體分散開(kāi)來(lái)，立即加入25μl 2XSDS凝膠加樣緩沖液，繼續振蕩20s。
（5）樣品在沸水浴中放置5min。
（6）采用帶有浸入尖頭或能在冷卻杯中同時(shí)處理多個(gè)樣品的超聲處理儀對DNA進(jìn)行剪切，根據所用超聲處理儀的輸出功率及其設定狀態(tài)，以最大功率處理0.5—2min應能有效地將裂解液粘度降至可控水平；
（7）樣品于室溫以12000g離心10min，將上清液移至另一管中，棄沉淀物；
（8）吸取經(jīng)剪切或超聲處理的樣品25μl電泳，剩余樣品保存于—20~C備用。
快速裂解酵母細胞制備樣本
使用這種方法會(huì )使蛋白質(zhì)變性，在所用抗體能識別變性靶蛋白時(shí)才能使用這一方法。
[試劑與設備]
（1）待檢測的酵母菌。
（2）25％三氯乙酸（TCA）
（3）1％SDS。
（4）丙酮。
（5）RIPA緩沖液：
50mmol／L Tris—HCl（pH7.5）
150mmol／L NaCl
1％ Nonidet P-40 （NP-40）
0.5％ 去氧膽酸鈉
0.1％ SDS
（6）玻璃珠（直徑0.45—0.50mm）。
（7）臺式離心機。
（8）水浴箱。
（9）渦漩振蕩器。
（10）加樣器與吸頭等。
[操作步驟]
（1）0°C以12000g離心lmin，從lml培養物中收集細胞，棄上清液（當靶細胞為分泌型蛋白時(shí)除外）。
（2）用0．5ml 25％三氯乙酸（TCA）重懸細胞。
（3）按步驟1離心回收細胞，重懸于1ml 90％丙酮中。
（4）按步驟（1）離心，估算沉淀物體積，加入等體積1％SDS重新懸浮沉淀物。
（5）加入經(jīng)酸處理的玻璃珠（直徑0．45—0．50mm）至溶液的彎月面處。
（6）振蕩懸液5次，每次間歇期間將懸液置于冰浴中冷卻lmin，在相差顯微鏡下監測細胞
（7）用一燒紅的皮下注射器針頭（23號）在微量離心管的頂蓋上穿一小洞，以防加熱過(guò)程中玻璃球沖出離心管。
（8）在沸水浴中加熱3min。
（9）把玻璃珠轉移到另一個(gè)微量離心管中，用0.5ml RIPA緩沖液洗滌原離心管，并把洗液合并于內裝玻璃珠的管中。
（10）在微量離心管底部打一小洞，回收細胞提取液，這一操作使用燒紅的皮下注射器針頭效果最佳。把仍裝載玻璃球的微量離心管置于另一空微量離心管上，把如此重疊的一對微量離心管，于4°C以2000g離心2min。
（11）回收下面一只內有細胞提取液的微量離心管，于4°C12以2000g離心5min，使提取液澄清，移出上清液置于另一個(gè)微量離心管中，—20°C貯存備用。
[注意事項]
酵母細胞提取液儲存于—20°C一般是穩定的，但是，如果待測蛋白被水解，則應在提取液中加入蛋白酶抑制劑，并保存于0°C。
哺乳動(dòng)物細胞和組織的樣本制備 【
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哺乳動(dòng)物細胞和組織的樣本制備（點(diǎn)擊播放）
哺乳動(dòng)物細胞和組織有單層培養細胞、懸浮培養細胞和組織碎片，雖然均可采用凝膠加樣緩沖液裂解的方法來(lái)制備樣本，但制備方法有所差異。
這里介紹其中兩種方法：①對單層細胞的處理方法 ②對懸浮培養細胞和組織碎片的處理方法
對單層細胞的處理方法
[試劑與設備]
（1）磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。
（2）1XSDS凝膠加樣緩沖液（參見(jiàn)“
細菌表達蛋白質(zhì)和樣本制備”）。
（3）水浴箱。
（4）吸管、細胞刮棒等。
[操作步驟]
（1）用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗細胞2次，棄去洗液并吸凈殘余的PBS液體。
（2）如直徑為90mm的平皿，則加人100-200μl加熱到85°C的1XSDS凝膠加樣緩沖液溶解細胞，用細胞刮棒把粘稠狀的細胞裂解物收集于一個(gè)微量離心管中。
對懸浮培養細胞和組織碎片的處理方法
[試劑與設備]
（1）懸浮緩沖液的配制：
0.1mol／L NaCl
0.01mol／L Tris—IICI（pH7.6）
0.001mol／L EDTA（pH 8.0）
1μl／ml Aprotinin
100μg／ml 苯甲基磺酰氟（PMSF）
（2）2XSDS凝膠加樣緩沖液（參見(jiàn)“細菌表達蛋白質(zhì)和樣本制備”）。
（3）臺式離心機。
（4）吸管或真空抽吸裝置。
（5）加樣器和吸頭等。
[操作步驟]
（1）取1s組織或109細胞，加lml冰預冷的懸浮緩沖液分散細胞或組織碎片（把細胞懸浮于上述緩沖液是為了防止加入2XSDS凝膠加樣緩沖液時(shí)形成不溶性團塊，這一步應使用冰預冷的懸浮緩沖液而且操作應盡可能迅速，以減少蛋白質(zhì)降解。大多數哺乳動(dòng)物組織可以在懸浮緩沖液液面之下迅速用鑷子分開(kāi)或用剪刀剪碎。）
（2）于4℃以3000g離心5min，估算離心管底部沉淀物的體積。
（3）吸出上清液，用連接于抽真空裝置的一次性使用吸頭把管壁上的液滴吸凈。
（4）盡快加入等體積的2XSDS凝膠加樣緩沖液。
[注意事項]
PMSF 嚴重損害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸人、吞進(jìn)或通過(guò)皮膚吸收后有致命危險。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應立即用大量水沖洗之，凡被PMSF污染的衣物應予丟棄。PMSF在水溶液中不穩定，應在臨用前從儲存液中現加于裂解緩沖液中。PMSF在水溶液中的活性喪失速率隨pH的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值為8.0時(shí)，20μmol／L的PMSF水溶液的半壽期大約為35min，PMSF通常配成10mmol／L或100mmoL／L濃度的貯存液（1.74或17.4mg／ml溶于異丙醇中）保存于-20℃。
免疫沉淀蛋白的樣本制備
一般情況下，粗提樣品無(wú)需進(jìn)一步純化即可直接進(jìn)行凝膠電泳。但下述兩種情況在免疫印跡之前，使用免疫沉淀制備蛋白的效果較好。一是含量極稀少蛋白的檢測，由于適合凝膠電泳分辨的蛋白質(zhì)總量有一定限度，通常不可能在凝膠中加入足夠量的蛋白質(zhì)樣品來(lái)檢測含量極稀少的抗原，此時(shí)可采用標準的免疫沉淀技術(shù)純化和濃縮待測蛋白；二是免疫沉淀可用來(lái)確定蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，此時(shí)，用于免疫沉淀的抗體和免疫印跡的抗體分別針對復合物中的不同蛋白質(zhì)，如果清楚該復合物的性質(zhì)，并知道應該使用何種抗體時(shí)，這種方法就非常有用，為研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用提供了一種有效的方法。
[試劑與設備]
（1）樣品緩沖液。
Tris／Glyeine SDS—PAGE樣品緩沖液是：2％SDS，100mmol／L DTT（取自—20°C存放的lmoL／L貯存液，臨用前加入），60mmol／L Tris（pH6.8），0.01％溴酚藍和10％甘油。
（2）水浴箱。
（3）加樣器和吸頭等。
[操作步驟]
（1）將樣品緩沖液加人吸附有抗原和抗體，并經(jīng)過(guò)洗滌的A蛋白或C蛋白微珠中。使樣品緩沖液和微珠的體積比率至少為2：1—5：1左右更好，但一般不超過(guò)10：1.
（2）樣品置70°C水浴加熱至少5min。除特殊情況外，在凝膠內加樣之前不必去除微珠。
（3）樣品既可立即使用也可凍存?！?0°C存放的樣品可穩定保存數月。
[注意事項]
（1）對照設置：實(shí)驗對照的設置應包括能與免疫抗體共沉淀的樣品和能與非免疫抗體共沉淀的樣品。通過(guò)兩者比較可以鑒別抗體所形成的特異性條帶和非特異性條帶（例如，來(lái)自于重鏈的條帶）。此外還應該包括含有已知的或標準量的待測抗原的陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性對照可以是含有已知或標準量待測抗原的任何樣品，來(lái)源于細菌或桿狀病毒超常表達系統或來(lái)源于已充分鑒定的細胞系。該樣品不必經(jīng)過(guò)免疫沉淀但應在臨近的膠道和其他樣品同時(shí)上樣電泳。這樣能夠提示免疫印跡是否成功，并對抗原的相對分子量進(jìn)行精確比較。如果陽(yáng)性對照中抗原的量是已知的，可粗略估計待測樣品中抗原的含量。
（2）常見(jiàn)問(wèn)題與解決方法：有一個(gè)值得注意的問(wèn)題，將免疫沉淀制備的蛋白用于免疫印跡時(shí)，來(lái)自免疫沉淀的抗體會(huì )出現在印跡膜上。該抗體可被二抗試劑檢出。通?？贵w重鏈和輕鏈的大小并不干擾待測抗原的鑒定。然而，若待測抗原的大小在50kD或25kD左右（大約為重鏈和輕鏈多肽的大?。?，則難以對待測抗原進(jìn)行鑒定。出現這種情況，有兩種解決辦法：一是可將免疫沉淀抗體共價(jià)結合在A(yíng)蛋白或C蛋白微珠上；其二是采用直接檢測技術(shù)進(jìn)行測定。
蛋白質(zhì)凝膠電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE），是目前對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、純度鑒定及分子量測定的主要方法之一。十二烷基磺酸鈉（SDS）是一種陰離子去污劑，可與蛋白質(zhì)結合，使蛋白質(zhì)變性并帶上大量負電荷。SDS-PAGE是最常用的凝膠電泳技術(shù)。它通常采用不連續電泳系統，即用上層膠（成層膠）和下層膠（分離膠）兩種不同濃度的凝膠灌制凝膠板，見(jiàn)圖2.SDS-PAGE通過(guò)其電荷效應、濃縮效應和分子篩效應，達到蛋白質(zhì)高分辨率的分離效果。
圖2 SDS-PAGE凝膠分層示意圖
待分離蛋白質(zhì)樣品在電泳中的泳動(dòng)速度，或相對遷移率（Mr）與蛋白質(zhì)本身性質(zhì)（如分子大?。?、凝膠孔徑和電泳條件（如電流、電壓）等密切相關(guān)，蛋白質(zhì)結合大量的SDS后，各組分之間的的形狀和電荷差異被抵消，此時(shí)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中泳動(dòng)速度的快慢，僅與各自分子量的大小有關(guān)。因此，可根據下列公式計算分子量大小:
lgMW=lgK—bMr
其中，MW為蛋白質(zhì)的分子量，K為常數，Mr為相對遷移率，b為斜率。將已知分子量的幾種標準蛋白質(zhì)在電泳中的相對遷移率對其分子量的對數做圖，即可得到一條蛋白質(zhì)分子量校正曲線(xiàn)。根據待測樣品的相對遷移率，可由校正曲線(xiàn)查到其分子量大小，蛋白質(zhì)樣品中加SDS煮沸后，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，為保護和還原二硫鍵，尚需加還原劑2-巰基乙醇（2-ME）或二硫蘇糖醇（DTT）。蛋白質(zhì)變性使亞基聚合形式存在的蛋白質(zhì)解聚成單個(gè)亞基。因此，對于一個(gè)純化蛋白質(zhì)，可經(jīng)SDS-PAGE確定其亞基種類(lèi)、數目及大小。上述蛋白質(zhì)分子量測定更確切地說(shuō)是蛋白質(zhì)分子各亞基分子量的大小。
丙烯酰胺凝膠孔徑對電泳速度及分離效果影響很大。凝膠孔徑的大小取決于丙烯酰胺（Aery）單體及N，N—亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）的含量及比例?？偰z濃度（T）可在3％～30％范圍內變動(dòng)，T為8％～15％的凝膠，適用于大多數蛋白質(zhì)樣品的分離。交聯(lián)度（C）是反映凝膠聚合情況的一個(gè)指標。凝膠聚合過(guò)程中，Acry單體之間形成延伸的多聚鏈，并通過(guò)Bis的作用，連接和交叉成網(wǎng)狀結構，最終成為肉眼可見(jiàn)的凝膠。催化劑過(guò)硫酸銨（APS）和加速劑四甲基己二胺（TEMED）直接影響凝膠聚合質(zhì)量。二者加量過(guò)多，會(huì )使Acry單體聚合鏈較短，聚合不充分，膠的脆性增加；反之，如加量過(guò)少，則聚合速度大大降低，甚至只出現所配制的膠溶液黏度稍增加、無(wú)膠狀物出現的現象。見(jiàn)圖3.
圖3 相對遷移率與分子量對數關(guān)系簡(jiǎn)圖
根據電泳的目的和要求及樣品的特點(diǎn)，可采取恒流或恒壓條件進(jìn)行電泳。
由于印跡技術(shù)需將蛋白質(zhì)成功地從膠中轉移至膜上，因此，選擇合適的凝膠甚為重要。一般情況下，丙烯酰胺和交聯(lián)劑的比例越低，轉移就越易進(jìn)行。超薄膠轉移的速度快，而且徹底。通常，應根據目的選擇厚度、大小均適合的凝膠。若想尋求蛋白質(zhì)的最佳分辨力，長(cháng)膠的效果較好，使較大分子量的蛋白質(zhì)更好地分離。若想達到最大的靈敏度，膠的厚度可增加到1.5mm，并且在不發(fā)生變形的前提下，盡量提高蛋白的上樣量。若主要考慮的是分離速度，則選用微型膠，厚度為0.5mm。表1顯示SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍。
表1 SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍
試劑與器材
（1）Acry／Bis貯存液：29.2gAcry，0.8gBis，加60m1雙蒸水充分溶解后，再加雙蒸水至100ml。過(guò)濾后，于4℃避光保存。
（2）分離膠緩沖液：1.5mol／L Tris-HCl，pH8.8：18.15g Tris，溶于60ml雙蒸水中，用1mol/L HCl調pH至8.8，加雙蒸水至100ml，于4℃保存。
（3）成層膠緩沖液：0.5mol／L Tris-HCl，pH6.8：6.0g Tris，溶于60ml雙蒸水中，用 1mol／LHCl調pH至6.8，加雙蒸水至100ml，于4℃保存。
（4）10％APS：1.0g APS加10ml雙蒸水溶解，一20℃分裝凍存，或新鮮配制。
（5）TEMED：原液。
（6）10％SDS：10g SDS溶于80m1雙蒸水中，加熱攪拌至完全溶解，定容至100ml。室溫保存。
（7）50％甘油：50ml甘油加50ml雙蒸水，配成100ml溶液。
（8）樣品緩沖液（6X）：成層膠緩沖液1.Oml，50％甘油0.8ml，10％SDS 1.6ml，2-ME0.4ml，0.05％溴酚藍0.2ml，雙蒸水4.0ml?；旌暇鶆蚝?，分裝凍存。
（9）電極緩沖液（1X）：pH8.3：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，1.0g SDS，加雙蒸水至1000ml。
（10）蛋白質(zhì)分子量標準晶：蛋白質(zhì)分子量標準（高分子量和低分子量）均有商品供應。
（11）垂直板電泳裝置：電泳槽（JM—250型，大連）。
（12）電泳儀。
（13）玻璃微量進(jìn)樣器：加樣槍配扁而長(cháng)的加樣頭亦可。
操作步驟 【
動(dòng)畫(huà)】
（1）將兩塊玻璃扳組成的灌膠模具（其中一塊上口帶有凹槽，另一塊內面兩側粘有凝膠板隔離膠條，膠條厚度為0.5mm、0.75mm、1.0mm，按所需凝膠厚度選擇）洗凈、晾干，按圖4安裝好。
圖4 灌膠模具安裝示意圖
（2）選擇合適的分離膠濃度，按表2配制所需分離膠溶液。
表2 分離膠溶液配方
（3）將分離膠液混合后緩慢倒入玻璃板之間，并即刻在膠表面用滴管沿凝膠板內壁滴加2～3mm高的水飽和正丁醇（無(wú)水乙醇亦可），以防止空氣中的氧擴散進(jìn)入膠液，影響聚合（膠液與正丁醇分界面可見(jiàn)清晰的折光線(xiàn)）。
（4）待分離膠聚合后（約30～40分鐘），傾去表面液體，用少量分離膠緩沖液洗2～3次，多余的液體用濾紙條吸干。
（5）配制成層膠緩沖液：3.05ml雙蒸水，0.65ml Acry／Bis液，1.25ml成層膠緩沖液，50μl 10％SDS 50μl 10％APS，5μl TEMED?？傮w積5.0ml，T為4％。
（6）將成層膠液混合后，緩慢加到分離膠表面，至凹口玻璃板上緣。小心插入梳子（梳子應在步驟1安裝完畢后，預先試一下是否合適），注意排除氣泡。
（7）30分鐘至1小時(shí)后，小心拔出梳子，去掉四周封閉乳膠管，將凝膠板與上、下電泳槽連接好。
（8）上層電泳槽中加電極緩沖液沒(méi)過(guò)加樣孔，并用電極緩沖液沖洗加樣孔。如個(gè)別孔發(fā)生扭曲，可將玻璃微量進(jìn)樣器針頭插入孔中，把孔間的短膠柱推正。
（9）待測蛋白質(zhì)溶液中按1：4比例加樣品緩沖液，如為沉淀及凍干粉，樣品緩沖液應稀釋4～5倍后加入，并使樣品充分溶解。蛋白質(zhì)分子量標準按商品說(shuō)明書(shū)處理。沸水浴中煮3～5分鐘后上樣。
（10）恒壓電泳。樣品在成層膠中泳動(dòng)時(shí)，電壓為100V，進(jìn)入分離膠后，電壓增至150～200V（約15V／em）。為防止電泳產(chǎn)熱過(guò)多，應外接冷卻水裝置。
（11）當樣品緩沖液中的溴酚藍指示劑移至凝膠底部時(shí)，終止電泳（約3小時(shí)左右）。取出凝膠板，小心將兩板之間的膠移至較大的表面皿中。此凝膠可直接進(jìn)行染色觀(guān)察；亦可進(jìn)一步通過(guò)免疫印跡技術(shù)，對待測蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。
注意事項
（1）分離膠中加入少量甘油可增加膠的柔韌性，使膠不易破裂。
（2）配制膠液時(shí)，最后加APS和TEMED，加入后即刻使膠液充分混合，但要防止劇烈搖晃而產(chǎn)生氣泡。
（3）表中所加試劑的量是依據灌制面積為14cm×l4cm，厚度為1mm的凝膠而設定，其他規格的凝膠板試劑用量可參考此表，進(jìn)行適當調整。
（4）Acry、Bis具有神經(jīng)毒性，實(shí)驗中應帶手套操作。
（5）可選用恒流條件進(jìn)行電泳，如：樣品在成層膠中泳動(dòng)時(shí)，電流為30mA，進(jìn)入分離膠后，電流增加至40mA；亦可以4～5mA低電流，電泳過(guò)夜，次日增加電流至10～12mA 5～10分鐘，以改善樣品的少量擴散。
（6）待分離樣品的質(zhì)、量直接影響電泳效果，如：若電泳出現波浪線(xiàn)，則說(shuō)明上樣量過(guò)多，應減少上樣量；若樣品中含鹽濃度過(guò)高，應先透析，以便除掉鹽分；若樣品黏度過(guò)大（如細胞蛋白質(zhì)），最好先用超聲波破碎染色體DNA后再電泳。
（7）如果待分離樣品中蛋白質(zhì)組分分子量的變化幅度大，則應考慮用梯度發(fā)生器制備5％～20％的梯度膠，以達到滿(mǎn)意的分離效果。
基本原理 【
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將蛋白質(zhì)從凝膠中轉印致膜上（點(diǎn)擊播放）
電泳后蛋白質(zhì)樣品轉移的方法，包括半干式轉移、濕式轉移等。各種轉移方法原理相似，都是將膜與膠放在中間，上下加濾紙數層，做成"Sandwich”樣的轉移單位，并且保證帶負電的蛋白質(zhì)向陽(yáng)極轉移，即膜側連接陽(yáng)極或面向陽(yáng)極（連接方式如圖5所示）。
圖5 轉移單位示意圖
可用于免疫印跡的固相載體有多種，硝酸纖維素膜、尼龍膜、帶正電荷的尼龍膜及PVDF（聚亞乙烯雙氧化物）膜。硝酸纖維素膜最為常用，具有結合能力強，膜不需要活化，背景淺，能進(jìn)行多次免疫檢測并可用常規染色方法，功能基團壽命長(cháng)等優(yōu)點(diǎn)，但極易破碎不易操作。尼龍膜軟且結實(shí)，較硝酸纖維素膜易操作，具有與蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-去污劑混合物有很高的結合力，每平方厘米可結合480pg蛋白（而硝酸纖維素膜只能結合80Pg），因此靈敏度高，背景也高，因為其高電荷密度使對其非結合區進(jìn)行封閉較為困難。帶正電荷的尼龍膜能有效地結合低濃度的小分子蛋白，酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖，當轉印液中有SDS時(shí)，蛋白質(zhì)容易從膜上泄漏，用甲醇固定能提高蛋白質(zhì)在尼龍膜上的保留指數。PVDF膜在制備多肽供蛋白質(zhì)化學(xué)分析中最為常用。在進(jìn)行蛋白水解和序列分析時(shí)，通常是先將蛋白質(zhì)結合在PVDF膜上。
將凝膠中的蛋白質(zhì)轉印至膜上的方法很多。目前常用方法是電洗脫或電印跡。其主要優(yōu)點(diǎn)是轉印迅速、完全。電洗脫有兩種方法：一種是濕轉印法，即將凝膠-膜夾層組合完全浸入轉印緩沖液中；另一種是半干轉印法，即將凝膠-膜夾層組合放在浸有轉印緩沖液的吸水紙之間。前者是將夾層組合放人有鉑絲電極的緩沖液槽中。而后者是將凝膠-膜夾層組合置于兩個(gè)石墨平板電極之間。這兩種轉印的裝置效果均較好，可根據實(shí)驗室條件來(lái)選擇。
試劑與器材
（1）電泳凝膠。
（2）轉移緩沖液：pH8.1—8.4：3.03g Tris，14.4g甘氨酸，200ml甲醇充分溶解后，加雙蒸水定容至1000ml。
（3）TBS緩沖液：1.21g Tris，8.77gNaCl，加HCl調pH至7.4，加水定容至1000ml。
（4）TTBS緩沖液：在TBS中加入Tween—20，濃度為0.1％，4℃保存1個(gè)月。
（5）封閉液：1.5g脫脂奶粉溶于50ml TTBS中，現用現配（用1％～3％的BSA，或10％胎牛血清亦可）。
（6）特異單克隆抗體：用封閉液適當稀釋。
（7）酶標第二抗體：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）標記。
（8）蛋白質(zhì)轉印膜：NC（硝酸纖維素）膜、PVDF（聚偏二氟乙烯）膜，或尼龍膜等均可。
（9）顯色底物。
（10）恒溫振蕩器。
（11）半干式電泳凝膠轉移儀。
（12）Whatman 3mm濾紙。
（13）手套。
（14）孵育及顯色用塑料盒。
（15）塑料袋。
（16）塑料封口機
操作步驟（半干式轉移）
1.轉移
（1）電泳后的凝膠先切除成層膠及需要進(jìn)行凝膠直接染色的孔道部分，并將膠剪一小角作為定位標記，然后放在轉移緩沖液中平衡30分鐘左右。
（2）將轉印膜1張及6張Whatman濾紙剪成與膠同樣大小。轉印膜用前需在轉移緩沖液中平衡10～15分鐘，濾紙用前在轉移緩沖液中浸濕即可。
（3）由下至上將3層濾紙、膜、凝膠及3層濾紙依次放好。每放一層都應注意排除氣泡。如有氣泡，可用光滑的玻璃棒或試管在各表面緩慢滾動(dòng)，予以排除。
（4）將轉移裝置連接好，接通電源。恒流下轉移，0.8mA／cm2，轉移30分鐘至1小時(shí)。
（5）關(guān)閉電源，取出膜，然后用雙蒸水漂洗l～2分鐘，放在濾紙中干燥備用。注意膜上要做好標記。
2．檢測
（1）將膜放在塑料盒中，加入適量封閉液，于37℃恒溫振蕩器上放置1小時(shí)，或4℃過(guò)夜。
（2）將膜轉入塑料袋中，加入用封閉液稀釋的第一抗體，于37℃或室溫孵育反應1小時(shí)。
（3）剪開(kāi)塑料袋，傾去第一抗體液體，用鑷子將膜移至塑料盒中，加TBS洗3次，每次15分鐘。
（4）加入稀釋好的酶標第二抗體，繼續在37℃或室溫孵育反應30分鐘至1小時(shí)。
（5）同步驟（3），洗膜。
（6）加底物顯色液。此步驟一般要求避光進(jìn)行。最好即時(shí)檢查一下，以控制顯色程度，防止本底過(guò)高及出現非特異條帶。
（7）終止反應，用雙蒸水大量沖洗，然后將膜放于雙層濾紙中干燥保存。
注意事項
（1）如采用PVDF膜，使用前應在甲醇中浸泡一下，再移至轉移緩沖液中平衡。另外，PVDF膜在檢測時(shí)，采用TTBS緩沖液。
（2）電泳凝膠一般可重復轉移1次，以獲得兩張相同的膜，第2次轉移的時(shí)間可略延長(cháng)。
（3）如待分析的蛋白質(zhì)分子量大，轉移時(shí)間也需延長(cháng)。
（4）上述顯色檢測方法僅給出了基本步驟，采用不同檢測系統，需按廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)具體操作。
（5）電泳轉移操作時(shí)，保證濾紙、膜、凝膠其間無(wú)氣泡存在是實(shí)驗的關(guān)鍵步驟。因即或有微小的氣泡殘留，電泳時(shí)局部溫度升高，氣泡膨脹會(huì )嚴重影響印跡結果。
轉印后切取印跡膜
有時(shí)轉印后需將印跡剪成較小的片狀進(jìn)行單獨處理。單個(gè)泳道可以泳動(dòng)同一樣品，待彼此分開(kāi)后，可用不同的抗體并列檢測。如以電泳方向剪膜，就可在同一樣品中檢測不同分子大小的抗原。為了簡(jiǎn)便而精確地找到泳道，電泳之后用麗春紅S（Ponceaus S）或印度墨汁對印跡膜進(jìn)行染色，便可很快確定待測蛋白質(zhì)的位置并將其剪下。表3表明兩種染料的適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)，用麗春紅S染色的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，價(jià)廉和具有可逆性，在封閉過(guò)程中，染色易消褪，且不干擾進(jìn)一步的檢測。
在某些情況下，可能想用印跡中的較高分子量區域來(lái)檢測一種抗原，用另一個(gè)區域來(lái)檢測另一不同分子量的蛋白質(zhì)。為了使印跡中不同的區域正好對應于相應分子量的范圍，這需要在對照泳道中加入已知分子量的蛋白質(zhì)。這樣可方便地在印跡中找到適當的區域并將其剪下。
使用預染的分子量標記，可為轉印后切下所需印跡提供良好的指示，此類(lèi)標記已商品化，但是比麗春紅S染色法昂貴。標記中的顏色除了增加成本對實(shí)驗并無(wú)不良影響，而且在泳動(dòng)時(shí)非常漂亮。
表3 用于免疫印跡染色的染料
印跡膜蛋白染色
[所需試劑]
（1）2％麗春紅S濃貯存液（3-羥基-4-[2-磺基-4-硫代-苯偶氮基]-2，7—萘二磺酸）：溶于30％三氯醋酸和30％磺基水楊酸中。貯存液可在室溫下穩定存放1年以上。
（2）PBS。
[操作步驟]
（1）在染色之前，先配制麗春紅S的應用液。即將2％的麗春紅S濃貯存液用1％醋酸1:10稀釋即成為應用液（注意：如果使用硝酸纖維膜，須將麗春紅S應用液更換為用水1:10稀釋?zhuān)?div style="height:15px;">
免疫檢測主要取決于抗原抗體的特異性，特別是能夠識別膜上變性的和固定化抗原的抗體。因印跡膜上有非特異性吸附蛋白質(zhì)的位點(diǎn)，因此需進(jìn)行封閉以防免疫試劑的非特異性吸附。將印跡膜與一定濃度的不參與特異性反應蛋白質(zhì)或去污劑溶液孵育可實(shí)現封閉。然后通過(guò)抗體與膜上抗原的特異性結合來(lái)定位抗原?？乖捎靡子^(guān)察的標記的抗體進(jìn)行檢測?？贵w本身可以標記，直接用于檢測抗原，但更為常見(jiàn)的是，使用的抗體是非標記的，而用標記的二抗采進(jìn)行抗原定位。
常用的標記方法有酶聯(lián)法，一般是用辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶，具體的介紹見(jiàn)本書(shū)第四章“免疫標記技術(shù)”。近年來(lái)，化學(xué)發(fā)光（CL）法已成為常用的方法之一。該法是基于環(huán)化二脂酰肼（cyclic diocyhydrazide）的化學(xué)氧化作用，生成一種不穩定的中間產(chǎn)物，當其衰變時(shí)即可發(fā)光。發(fā)出的光可使標準X-光片感光，產(chǎn)生較易識別的圖像?；瘜W(xué)發(fā)光法比過(guò)去使用的顯色或放射活性檢測法更加靈敏。盡管對靈敏度增加的幅度還有很多爭論，但一般認為比顯色法大約增加20倍，比放射活性檢測方法約增高 7倍。該法的關(guān)鍵是使用了辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物作為二抗或二級試劑。辣根過(guò)氧化物酶可與抗免疫球蛋白抗體、蛋白A、蛋白C或其他可與一抗特異結合的試劑共價(jià)結合。在過(guò)氧化氫存在的條件下，過(guò)氧化物酶催化魯米諾（氨基苯二酰一肼）氧化后即可發(fā)光。
表4 總結了常用的封閉液及其優(yōu)缺點(diǎn)。盡管這些封閉液在某些情況下使用較為滿(mǎn)意，但是仍需要仔細選擇以確保其能適合于檢測試劑。幾乎適合于所有檢測系統的兩種封閉緩沖液是脫脂奶粉和牛血清白蛋白。若蛋白質(zhì)封閉液造成本底過(guò)高或干擾檢測，則可試用吐溫20封閉液。
直接法是指用標記的第一抗體（一抗）來(lái)進(jìn)行檢測的方法，用這種類(lèi)型的抗體對膜上抗原進(jìn)行免疫檢測的本底較低，并且在同一張印跡膜上可同時(shí)使用來(lái)源或特異性不同的多種抗體，但靈敏度不如間接法。間接檢測是指先使用非標記的一抗，然后用可與一抗結合的標記第二抗體（二抗）進(jìn)行檢測的方法。由于二抗分子是多價(jià)的，具有放大效應，因而靈敏度較高。因此，除非需要直接檢測抗原的特異性，否則最好是選擇間接法進(jìn)行免疫印跡測定。通常選用與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白抗體商品試劑來(lái)檢測一抗，分別針對不同種屬來(lái)源的一抗。這樣，一個(gè)實(shí)驗室只需備用針對小鼠，大鼠，家兔和其他一抗的少數幾種通用試劑即可滿(mǎn)足各種免疫印跡實(shí)驗要求。
在準備做抗原檢測時(shí)，須考慮所用一抗和二抗的最佳濃度，對不同來(lái)源的抗體，其特異性林的濃度都不相同。因此，對一抗體進(jìn)行滴定有助于確定最佳反應比例，預先滴定二抗對實(shí)也有幫助，一旦確定最佳濃度，則每次印跡即可用同一批一抗、二抗來(lái)完成。多數情況下可用商家提供的濃度進(jìn)行檢測。
（1）PBS：稱(chēng)取8g NaCl；0.2gKCl；1.44g Na2HP04和0.24g KH2PO4，加蒸餾水800ml，用HCl調節溶液pH值至7.4，加水至1L，在1.034X105Pa高壓下蒸氣滅菌20min，室溫保存。
5）辣根過(guò)氧化物酶底物溶液：用9ml的0.01mol／L Tris-Cl（pH7.6）溶液中溶解6mg 3—3，—二氨基聯(lián)苯胺，加入lml 0.3％（w／v）NiCl2或CoCl2，用Whatmanl號濾紙過(guò)濾以除去沉淀，加入10yB0％H202混勻后立即使用。此溶液須在臨用時(shí)配制。
（2）加入一種封閉液（見(jiàn)表4）。注意：不同的抗原和實(shí)驗方法需用不同的封閉緩沖液。例如，BSA（V部分）和牛奶都含有磷酸化的酪氨酸和生物素，用特異性抗磷酸化酪氨酸抗體進(jìn)行實(shí)驗時(shí)，這會(huì )給解釋實(shí)驗結果造成一定的混淆，也給親合素／鏈霉親合素檢測的應用帶來(lái)一些問(wèn)題。某些牛奶制品可抑制堿性磷酸酶的活性。若無(wú)信號或檢測背景較高，則需嘗試不同的封閉緩沖液。
（5）加入工作濃度的一抗溶液。每張15X15cm的印跡膜用量為10ml。所有的稀釋液均用含有蛋白質(zhì)的溶液，例如1％BSA／PBS。孵育可在淺盤(pán)或塑料袋中進(jìn)行。在室溫下將抗體和印跡膜攪動(dòng)孵育至少1h。有人認為4℃孵育過(guò)夜（12～18h）可提高靈敏度。
（7）此時(shí)，印跡膜便可加人工作濃度的標記的二抗溶液?？稍跍\盤(pán)或塑料袋中室溫孵育1h?？贵w用含有蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)?1％BSA／PBS。商品化的酶標二抗應在0.5～5μl／ml濃度之間使用（通常將商品試劑原液稀釋成1：200～1:2000的應用液）。用辣根過(guò)氧化物酶標記的試劑
（9）將經(jīng)漂洗的印跡膜移至另一干凈淺盤(pán)中，按印跡膜面積加入0.lml／cm2的底物溶液（若使用堿性磷酸酶標記的二抗，用堿性磷酸酶底物溶液，若用辣根過(guò)氧化物酶標記的二抗則用辣根過(guò)氧化物酶底物溶液），于室溫輕輕搖動(dòng)，待蛋白條帶的顏色深度達到要求（約2-20min），用水略為漂洗，放人PBS中。
影響免疫印跡成敗的一個(gè)主要因素是抗原分子中可被抗體識別的表位的性質(zhì)。只有那些能識別耐變性表位的抗體可與抗原結合。多數多克隆抗血清中或多或少地含有這種類(lèi)型的抗體，所以在免疫印跡實(shí)驗中常選用多克隆抗體。相反，許多單克隆抗體不能與變性抗原反應，因為它識別的表位依賴(lài)于抗原蛋白正確折疊所形成的三維空間構象。表5顯示各種抗體的優(yōu)缺點(diǎn)。
