默認分類(lèi) 2007-12-25 17:52:51 閱讀991 評論0 字號：大中小 訂閱
一.所需儀器設備
1.電泳儀
2.垂直電泳槽
3.轉移電泳槽:濕轉或半干轉電泳槽
4.硝酸纖維素膜(NC膜)
5.暗盒
6.5x7cm X膠片
[注：電泳槽、玻璃板、梳子及膠條的清洗：自來(lái)水沖洗數次――去離子水沖洗數次2次――37C烤干備用。]
二.所用試劑
[注：配制及稀釋試劑均用去離子水，實(shí)驗器皿自來(lái)水清洗完畢再用去離子水沖洗]
1.Lysis buffer：RIPA 三去污劑裂解緩沖液
50mM Tris.Hcl 3.03g
150mM NaCl 生理鹽水 4.35g
0.02%NaN3（防腐劑，可以不加） 0.1g
0.1%SDS 強陰離子去污劑 0.5g
1% NP-40 去污劑 5ml
0.5% Sodium deoxycholate 去氧膽酸鈉 去污劑 2.5g
配制500ml,10M鹽酸調PH8.0, 4度保存。
使用前按1：50加入100mM PMSF(苯甲基磺酰氟，平時(shí)放-20度)和protease inhibitor(先溶在2ML水中，分裝在小管中，保存在-20度)，配好后馬上使用。也可分裝成(RIPA300ul+6ul100mM PMSF+6ulprotease inhibitor)(培養細胞及微小組織蛋白提取)若干管，-20度保存；分裝成(RIPA1000ul+20ul100mM PMSF+20ulprotease inhibitor)(較大組織蛋白提取)若干管，-20度保存。
[注：也可使用單去污劑裂解緩沖液，將1% NP-40換為1%Triton X-100。去掉0.1%SDS及0.5% Sodium deoxycholate 去氧膽酸鈉]
PMSF儲存液 100mM(17.4mg/ml)，溶于異丙醇。有效濃度100ug/ml。
2.150mM Nacl(0.87%Nacl,生理鹽水)
3.0.1mg/mL考馬斯亮蘭G-250溶液 蛋白定量用。用50ml 95%乙醇溶解100mg考馬斯亮蘭G-250,再加入100ml 85%磷酸，加水至1000ml。用Whatman濾紙過(guò)濾后，置棕色瓶4度保存。蛋白定量比色皿可用95%乙醇脫色。
4.考馬斯亮蘭脫色液 含50%甲醇、10%冰醋酸、40%去離子水。
5. 0.25%考馬斯亮蘭R-250溶液 染色用。100ml脫色液中加入0.25g考馬斯亮蘭R-250。
6.10mg/mlBSA，稱(chēng)取100mg小牛血清白蛋白溶于10ml滅菌去離子水中。置-20度冰箱保存。
7.1mol/L Tris-Hcl緩沖液,PH6.8
8.1.5 mol/L Tris-Hcl緩沖液,PH8.8
9.10% AP：過(guò)硫酸銨(Ammonium Persulfate,AP),Amresco分裝，為促凝劑,現配現用，準確稱(chēng)取AP 20mg于0.5ml離心管內(注：稱(chēng)量時(shí)可分裝數管室溫保存備用)臨用前加去離子水200ul溶解。配制好的AP溶液4C可保存1周。
10.TEMED,Amresco分裝，100ml包裝，為促凝劑,準確吸取TEMED 10ul于0.2ml離心管內,可分裝數管室溫保存備用。
11.10% SDS 在90ml去離子水中溶解10g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調節溶液的pH值至7.2，加入去離子水定容至100ml，室溫保存。
12.30% Acr 將29g丙烯酰胺和1gN,N’－亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中，加熱至37℃溶解之，補加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器(0.45孔徑)過(guò)濾除菌查證該溶液的pH值應不大于7.0，置棕色瓶中4度保存。
13.6xLoading buffer：6倍sample buffer
300mM tris.Hcl pH=6.8 ， 12% SDS ，0.6% bromophenol blue (溴酚藍)，60%Glycerol,甘油
Filted，分裝在1ml tube, 每毫升加43ul B-ME（β－巰基乙醇，還原劑），-20度保存。
14.蛋白Marker： 選擇最適分子量Marker(MBI公司蛋白Marker很好)
15.內參：可選擇最適分子量?jì)葏⒆?:3000-5000稀釋?zhuān)鏐-Actin(45KD，漿蛋白用)、GAPDH(36KD，漿蛋白用，上?？党缮锝?jīng)銷(xiāo))、B-Tubulin(核蛋白用)等。
16.1xTris-Glycine電泳緩沖液(PH8.3)
25mM tris,192mM Glycine, 0.1%(w/v)SDS,
500ml配方如下
Tris1.515g, glycine7.2g, SDS0.5g用去離子水加至500ml。加10M HCl約800ul，就可以調至pH8.3。
17.1xTransfer buffer(PH8.3)
25mM tris, 192mM Glycine, 20%Methanol（甲醇），ph為8.3
500ml配方如下
Tris 1.515g,glycine7.2g,100ml Methanol（甲醇），用去離子水加至500ml。加10M HCl約550ul，就可以調至pH8.3。
18. TBST Washing buffer：
50mM tris, 150mM Nacl, 0.1% Tween-20
1L配方如下
Tris 6.06g,NaCl8.7g,1mlTween-20,加入去離子水至1L，同時(shí)精確調準pH值為7.6。加10M HCl約4200ul，就可以調至7.6。Tween-20要在用前現加，未加Tween-20的稱(chēng)為T(mén)BS緩沖液。
19.5%的脫脂奶粉封閉液 用TBST Washing buffer配制。
20.一抗：santa原裝或北京中山分裝,一般做1:200-300稀釋。
21.HRP標記二抗：一般做1:3000-5000稀釋。二抗選擇原則如下：
如一抗為鼠抗人IgG, 二抗選擇羊抗(或兔抗)鼠HRP；
如一抗為羊抗人IgG, 二抗選擇鼠抗(或兔抗)羊HRP；
如一抗為兔抗人IgG, 二抗選擇羊抗(或鼠抗)兔HRP。
22.ECL化學(xué)發(fā)光顯色劑，或DAB顯色劑
三.總蛋白質(zhì)提取
1．培養細胞
1.1貼壁細胞數目達到培養皿(或培養瓶)底面積80－90%，最好前一天換上新的培養液。
1.2將培養液吸凈，用5ml左右4度PBS洗三次細胞平皿(洗凈培養液中的胎牛血清等外源性蛋白)，將PBS吸凈，加入triple-detergent lysis buffer，100mm培養皿加300ul。(蛋白質(zhì)種類(lèi)不同—漿蛋白、核蛋白、膜蛋白，細胞裂解液有所不同)如暫時(shí)不提取，可將培養皿-80度保存。
1.3輕輕的轉動(dòng)培養皿直到細胞被溶解下來(lái)，細胞刮輕輕刮下裂解物，并可見(jiàn)白色的核酸(DNA、RNA)沉淀，（約1分鐘）將所有的液體包括沉淀，吸入1.5ml離心管，旋渦混勻器30秒，放在冰上10分鐘使細胞充分裂解，然后，用4度離心機12000轉10分鐘。
1.4留10ul上清液做蛋白定量外，其余上清于另一1.5ml離心管(將蛋白樣品5份+1份6×loading buffe，6×loading buffe加入前用80度左右的水預熱一下，使其溶解充分。把樣品在100度的沸水中煮5分鐘使蛋白變性，離心管上標明蛋白含量，保存在-80度冰箱)
2.組織中蛋白提取
2.1特小的組織加300ulLysis buffer玻璃勻漿器中，冰浴中研磨數次，勻漿上清液吸入1.5ml離心管中，然后，用4度離心機12000轉10分鐘。吸取上清于另一1.5ml離心管，分裝，保存在-80度冰箱。留10ul上清液做蛋白定量。
2.2取50－100mg組織放入玻璃勻漿器中，加3倍體積Lysis buffer，冰浴中研磨數次，勻漿上清液吸入1.5ml離心管中，然后，用4度離心機12000轉10分鐘。吸取上清于另一1.5ml離心管，分裝，保存在-80度冰箱。留10ul上清液做蛋白定量。
四.蛋白質(zhì)定量
1.應用標準的Bradford法定量。
2.待測樣本各10ul＋90ul生理鹽水；標準管中分別加入10mg/mlBSA 0ul、2.5ul、5.0ul、7.5ul、10ul, 每管加生理鹽水至100ul(蛋白含量分別為0、25、50、75、100ug)，同時(shí)以100ul的生理鹽水作空白對照。各管加入考馬斯亮藍染料溶液1900ul至總體積2ml，混勻，室溫放置2分鐘。比色檢測作標準曲線(xiàn)，計算出各個(gè)樣品的蛋白含量。
3.比色定量：通過(guò)OD值，來(lái)計算蛋白量。統計軟件計算出結果；
五.樣品準備
1.將已定量的蛋白樣品5份+1份6×loading buffe，6×loading buffe加入前用80度左右的水預熱一下，使其溶解充分。把樣品在100度的沸水中煮5分鐘， (水中煮沸5分鐘，目的是讓蛋白變性，由四級結構變成一級結構。注意事項：煮沸時(shí)，一定不要讓離心管口彈開(kāi)進(jìn)入水，要隨時(shí)觀(guān)察。)
2.一般來(lái)講蛋白上樣量30ug；計算出每個(gè)樣品30ug所用的體積，在樣品管上標記體積數值，以后直接吸取就行了。
3.等體積上樣：用事先準備好1×loading buffer，調成15ul相同體積。這樣條帶整齊。
六.蛋白電泳
1.分離膠制備
1.膠的選擇：膠的濃度越大，所能分離蛋白的分子量越小。（阿恒覺(jué)得這里一般還是10%到15%的比較常用）
7.5% :45—200KD
10%: 31----200KD
12%: 21.5---200KD
15%6.5---200KD
2.10ml 10%分離膠制備
去離子水 3950ul
30%Acr 3350ul
1.5MTris-Hcl,PH8.8 2500ul
10%SDS 100ul
混勻;依次快速加入10%AP 100ul及TEMED 4ul,充分混勻但不要產(chǎn)生氣泡。（這部很關(guān)鍵）
3.立即灌膠，不要產(chǎn)生氣泡，如有氣泡可用10ml注射器針頭排除。在每側膠板加膠至紅色塑料板的下緣處即可（差不多4－5ml）
4.沿玻璃板壁緩慢加去離子水1cm高度，隔絕空氣，分離膠室溫凝固2小時(shí)以上。也可4度冰箱過(guò)夜。
2.5%積層膠制備
(配制積層膠前先傾斜玻璃板，使上面水層匯聚于一邊，用10ml注射器吸取干凈，靜置10分鐘左右，使水分蒸發(fā)干凈)
2.1 4ml 5%積層膠制備
去離子水 2800ul
30%Acr 660ul
1MTris-Hcl,PH6.8 500ul
10%SDS 40ul
混勻;依次快速加入10%AP 40ul及TEMED 4ul,充分混勻但不要產(chǎn)生氣泡。立即灌膠，不要產(chǎn)生氣泡，如有氣泡可用10ml注射器針頭排除。
2.2插上梳子，積層膠室溫凝固30分鐘以上。小心撥出梳子，若膠孔有歪斜，則用注射器加以修正，吸出氣泡；（歪斜一般出現在基層膠凝固時(shí)間過(guò)短，或者配置比重過(guò)低，可用針頭撥亂反正之，但是難度很高，容易挑破）
2.3去掉膠條，加入甘氨酸電泳緩沖液，內外持平；
2.4清洗膠孔：去除沒(méi)有凝聚的Acr，并清除氣泡。
3.點(diǎn)樣：使用20ul的加樣槍?zhuān)捎?#8220;對側加樣法”加樣。
4.電泳
電泳在4度冰箱中進(jìn)行，積層膠90V，30分鐘左右，待溴酚蘭指示劑到達分離膠表面時(shí)改變電壓120-130V，2小時(shí)左右――此方法可以保持膠內受熱均勻，電流、電場(chǎng)均勻，條帶齊規整）
5.剝離膠：在平皿中，用手術(shù)刀片小心剝離，切掉積層膠，取出分離膠，用于下一步試驗。
七.轉膜
1.準備一大的玻璃培養皿，
2.Tansfer buffer：配制500ml（一部分倒于玻璃皿中，以分離膠－制作夾心餅）；取膠－修剪膠：取膠時(shí)手應錯開(kāi)分離玻璃，使膠取出，去掉積層膠部分，修剪周邊使其與預先制作好的硝酸膜大小一致，約長(cháng)8cm、高5cm左右，NC膜用剪刀在一個(gè)角剪一個(gè)標記；制作夾心餅：黑負白正，從近負極面依次為“黑夾板＝海棉－濾紙（5層）－膠－膜－濾紙（5層）－海棉＝白夾板”形象“漢堡”或“夾心餅”；用玻璃棒趕盡氣泡]（這步要一層層的趕氣泡，氣泡非常影響轉膜結果）
3. Transfer time
4度6-12小時(shí)（4C轉膜過(guò)夜，時(shí)間根據分子量的大小調整，大分子可以12小時(shí)，小的6小時(shí)左右）
4.將膜取下，用去離子水洗。
八.Western blot
blot之前可以用麗春紅（ponceaus）染NC膜，以觀(guān)察蛋白轉膜情況（是否完全、條帶是否齊）。然后用自來(lái)水或washing buffer洗掉麗春紅后進(jìn)行印跡?？梢耘軆蓧K膠，一塊blot，一塊染色觀(guān)察。（其實(shí)，恩，染過(guò)色的膠洗掉還是可以用的，吼吼?。?
步驟：
1.裁膜：根據電泳后蛋白Marker的位置，裁剪所需目的蛋白、內參對應的膜。
2.封閉抗體：將膜放入自制blot袋；封閉液用5％的美國脫脂奶粉（用TBST wash buffer配制），blot with milk for 1h RT，也可4度過(guò)夜。（這個(gè)做袋袋，也是很有意思地 = = 哈哈?。?
3.加一抗：blot in primary antibody for 1.5h RT（抗體用milk稀釋?zhuān)?
4.洗膜：wash with TBST wash buffer 5times, each time 3mins
5.加二抗：blot in secondary antibody 1h RT （抗體用milk稀釋?zhuān)?
6.洗膜：wash with TBST wash buffer 5times, each time 3mins
九ECL顯色
1.加ECL試劑10ml于100mm玻璃培養皿中，再加30%雙氧水6ul(帶上手套，防止腐蝕皮膚)（萬(wàn)一腐蝕了，皮膚變成白色的，又疼又養，這是一個(gè)比偶倒霉的哥哥告訴偶的）,搖勻。
2.用濾紙吸干NC膜上水分，將膜放入ECL顯色液中顯色，肉眼看到條帶后，就可以取出，顯色強的約幾秒鐘，顯色弱的時(shí)間長(cháng)些，但是不可以超過(guò)3分鐘。
十.放射自顯影,沖洗膠片
1.放射自顯影操作在暗室進(jìn)行。紅色燈光下可避免底片曝光。切忌底片濕水。
2.用濾紙吸干膜上ECL顯色液,先將膜放入暗盒內，再放X膠片，根據目的條帶ECL顯色的強弱決定曝光時(shí)間。 （伸手不見(jiàn)5指的曝光，經(jīng)常大眼瞪小眼的看條帶）
3.目的條帶ECL顯色肉眼可以看到的話(huà)，說(shuō)明比較強，曝光時(shí)間可以短些，“3分鐘、5分鐘各一張＋必不可以少的10分鐘一張”；肉眼看不見(jiàn)，曝光時(shí)間可以長(cháng)些，“不可以少的10分鐘，15分鐘、30分鐘各一張”。
4.一般來(lái)說(shuō)，曝光三張已足夠用。（偶一口氣爆上6張，左眼看3張，右眼看3張，嘿嘿~~）
5.放射科沖洗X膠片，讀片。
6.X膠片掃描保存。
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