A． 實(shí)驗過(guò)程
一、 實(shí)驗原理：2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點(diǎn)不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同，而將一向分離后的蛋白進(jìn)一步分離。這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的信息。
二、 實(shí)驗步驟：
1. 樣品的溶解
取純化后的晶體蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右，共處理一個(gè)小時(shí)。其中每隔10～15分鐘振蕩一次，然后13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清分裝，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法測蛋白含量
取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測定BSA標準曲線(xiàn)及樣品蛋白含量。
取7個(gè)10ml的離心管，首先在5個(gè)離心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分別加入2 ul的待測樣品溶液，再在每管中加入相應體積的雙蒸水（總體積為80ul），然后，各管中分別加入4ml的Bradford液（原來(lái)配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過(guò)濾一遍方能使用），搖勻，2min在595nm下，按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值，再測樣品OD值。(測量過(guò)程要在一個(gè)小時(shí)內完成)。例如：
編號 蛋白量（ul） Buffer(ul) Bradford(ml) OD595值
1 0 80 4 0
2 5 75 4 0.024
3 10 70 4 0.061
4 15 65 4 0.091
5 20 60 4 0.116
Bt4 2 78 4 0.079
Bt4 4 76 4
轉Bt4 2 78 4 0.075
轉Bt4 4 76 4
標準曲線(xiàn)方程式：Y= aX+b.其中Y為 OD值，X為蛋白含量。 a、b通過(guò)作圖輸入數據可知
相關(guān)系數通過(guò)輸入數據，作圖，軟件分析可得
OD值測量過(guò)程：
比色皿用70%的乙醇保存，待用時(shí)用雙蒸水沖洗，再用無(wú)水乙醇沖洗，雙蒸水沖洗，再加入待測樣品溶液潤洗，然后，加入樣品，測定OD值。
3. 雙向電泳第一向---IEF（雙向電泳中一律使用超純水）
3.1 水化液的制備
稱(chēng)取2.0mg 的DTT，用700ul水化液儲液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚蘭，3.5ul（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻，13200rpm離心15min 除雜質(zhì)，取上清。
在含300ug 蛋白（經(jīng)驗值）的樣品溶解液中加入水化液，至終體積為340ul， 振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清。
3.2 點(diǎn)樣，上膠
分兩次吸取樣品，每次170ul, 按從正極到負極的順序加入點(diǎn)樣槽兩側，再用鑷子撥開(kāi)ImmobilineDryStrip gels (18cm，pH 3—10)膠條，從正極到負極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品。注意：膠條使用前，要在室溫中平衡30分鐘；加樣時(shí)，正極要多加樣，以防氣泡的產(chǎn)生；壓膠時(shí)不能產(chǎn)生氣泡；酸性端對應正極，堿性端對應負極；樣品加好后，加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad)，兩個(gè)上樣槽必須與底線(xiàn)齊平。
3.3IPG聚焦系統跑膠程序的設定（跑膠溫度為20oC）
S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)
S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)
S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step) 共計44110vhs, 19.5小時(shí)
其中S1用于泡脹水化膠條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦
3.4 平衡
用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后，在濾紙上吸干（膠面，即接觸樣品那一面不能接觸濾紙，如果為18cm的膠條要將兩頭剪去），再以超純水沖洗，濾紙吸干（再次沖洗過(guò)程也可省略），然后用鑷子夾住膠條以正極端（即酸性端）向下，負極端（即堿性端）向上，放入用來(lái)平衡的試管中（鑷子所夾的是堿性端，酸性端留有溴酚蘭作為標記），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。注:平衡時(shí)要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁。
平衡第二次時(shí)，在沸水中煮Marker 3min,剪兩個(gè)同樣大小的小紙片，長(cháng)度與一向膠條的寬度等同，然后吸取煮好的Marker，轉入SDS—PAGE膠面上，保持緊密貼合；同樣在第二次平衡時(shí)，煮5%的瓊脂糖10ml。
4. 雙向電泳第二向---SDS-PAGE
4.1 配膠(兩根膠條所用劑量)
分離膠：（T=8%80 ml）：溶液于真空機中抽氣后再加APS和TEMED
30 % 丙烯酰胺儲液 21.28ml
分離膠buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul
雙蒸水 38.72ml
濃縮膠：（T=4.8% 10ml）
30 % 丙烯酰胺儲液 1.6ml
濃縮膠buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul
雙蒸水 5.9ml
4.2 灌膠
將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇壓膠,凝膠后(這時(shí)會(huì )出現三條線(xiàn)),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇壓膠,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保險膜封好。
4.3 轉移
剪兩個(gè)小的濾紙片，吸取Marker后，放入SDS—PAGE膠面的一端。然后，將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5%的瓊脂糖溶液在膠面上(瓊脂糖凝膠在轉移前十幾分鐘的時(shí)候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態(tài),至用之前再拿出來(lái)),再將IPG膠條緩緩加入SDS—PAGE膠面,其中不斷補加5%的瓊脂糖溶液,注意不能產(chǎn)生氣泡。
4.4 跑膠
濃縮膠13mA 分離膠20mA 共約5.5個(gè)小時(shí)
5. 銀染(兩根膠條所用劑量)（銀染特別注意用超純水）
5.1固定 30min 無(wú)水乙醇 200ml+乙酸50ml，用超純水定容至500ml
5.2敏化 30min 無(wú)水乙醇 150ml
Na2S2O3?5H2O1.5688g
無(wú)水乙酸鈉 34g
先用水溶解Na2S2O3?5H2O和乙酸鈉,再加乙醇,最后定容至500ml
5.3洗滌 5min×3次
5.4銀染 20min AgNO3 1.25g 用超純水定容至500ml
5.5洗滌 1min×2次
5.6顯影 無(wú)水Na2CO3 12.5g 用超純水定容至500ml
甲醛(37%)0.1ml, 臨時(shí)加
5.7終止 10min EDTA—Na2?2H2O7.3g用超純水定容至500ml
5.8洗滌 5min×3次
注：整個(gè)雙向電泳實(shí)驗中全部使用超純水，盡量減少離子的影響。
B． 實(shí)驗相關(guān)試劑配制
1． Bradford 工作液
95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考馬斯亮蘭G250，溶解完后再加磷
85%磷酸 52ml 酸，最后超純水定容至500ml。過(guò)濾后置于棕色瓶
考馬斯亮蘭G250 0.035g 外加油皮紙保存（Bradford不穩定，一周內有效）
2． 裂解液
尿素 8M
硫脲 2M
CHAPS 4%
DTT 60 mM
Tris—base 40 mM（如果有條件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate）
3. 水化液儲液
尿素 8M
硫脲 2M
CHAPS 4%
Tris—base 40 mM
4. 分離膠buffer (pH8.8) 250ml
SDS 0.4% 1g
Tris—HCl 1.5M 45.4275g
5. 濃縮膠buffer (pH6.8) 100ml
SDS 0.4% 0.4g
Tris—HCl 0.5M 6.07g
6. 凝膠儲存液（30%的丙烯酰胺） 250ml
Acr 29.2% 73g
Bis 0.8% 2g
7. 電極緩沖液（跑一次要配制2500ml）
甘氨酸 43.2g 36g
Tris 9g 或 7.5g
SDS 3g 2.5g
超純水定容至3000ml 超純水定容至2500ml
8． 0.5M Tris —HCl pH 6.8儲液
6.1g Tris先用30ml超純水溶解，再用46ml，3M HCl調pH6.8,再加水定容至100ml
9． 平衡液儲液
脲（即尿素） 36g
甘油 30% 30ml
SDS 1% 1g
0.5M Tris—HCl pH6.810ml 超純水定容至100ml
10. 平衡液A（一根膠條）
DTT 20mg
平衡液儲液 10ml
11．平衡液B（一根膠條）
碘乙酰氨 300mg
平衡液儲液 10ml
0.05%溴酚蘭 15ul (平衡液A、B均需臨時(shí)配制)
12．0.5%瓊脂糖10ml
瓊脂糖 0.05g
電極緩沖液 10ml
溴酚蘭 25ul
補：4、5、6的溶液需過(guò)濾后儲存于4OC備用。
C． 藥品
CHAPS 兼性離子去垢劑 去垢劑可破壞蛋白質(zhì)分子之間的疏水相互作用，
SDS 離子型去垢劑 提高蛋白質(zhì)的溶解性，防止在等電聚焦時(shí)析出
尿素 離液劑 可改變或破壞氫鍵等次級鍵的結構，使蛋白質(zhì)
硫脲 離液劑 變性并使蛋白失活。尿素和硫脲聯(lián)合使用，可
以大大增加蛋白質(zhì)的溶解性
DTT 還原劑 斷裂蛋白質(zhì)分子中Cys殘基之間形成的二硫鍵，增加蛋白質(zhì)的溶解性。但過(guò)分提高DTT的濃度，由于它pKa在8左右，因而會(huì )影響pH梯度。DTT在堿性pH下會(huì )去質(zhì)子化，等電聚焦時(shí)會(huì )損耗，導致二硫鍵復原，蛋白質(zhì)沉淀
BSA Bradford中制作標準曲線(xiàn)用
無(wú)水乙醇 和磷酸一起，提供Bradford中的環(huán)境
磷酸 提供Bradford中的酸性環(huán)境
Tris 構成緩沖液的成分，可用于抗衡pH的變化
IPG buffer
覆蓋液 即礦物油，防止水分蒸發(fā)，樣品干燥。
丙烯酰胺（Acr） 以丙烯酰胺為單體，甲叉二丙烯酰胺為交聯(lián)劑，
甲叉二丙烯酰胺 （Bis） 在催化劑（Aps）和引發(fā)劑（TEMED）作用下，聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構
瓊脂糖
溴酚蘭 指示劑作用
碘乙酰氨（IAA） 平衡液B中使用，中和A液中的DTT
正丁醇 比聚丙烯酰胺密度小，用于凝膠制作過(guò)程中的壓膠
甘油 無(wú)機鹽的良好溶劑，熱穩定性好
Marker
考馬斯亮蘭G250（Bradford法用） 考馬斯亮蘭G250有紅、藍兩種不同顏色的形式在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當與蛋白結合后，產(chǎn)生藍色化合物，反應迅速而穩定，反應化合物在465~595nm處有最大的光吸收值，化合物顏色 深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系，因此可檢測595nm的光吸收值的大小計算蛋白的含量
甘氨酸 與Tris構成緩沖系統
AgNO3
EDTA 金屬螯合劑，可以結合銀離子，終止銀染過(guò)程
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2006-12-11
蛋白質(zhì)組研究第一步：雙向電泳蛋白樣品制備
開(kāi)篇之際，首先來(lái)看看這兩句話(huà)：
“在制備中丟失的蛋白是永遠不可能在后面的實(shí)驗中彌補回來(lái)的”，
“讓我們把蛋白質(zhì)看作是具有獨特而奇妙性質(zhì)的實(shí)體”。
在直擊蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)全過(guò)程 一文中就提到過(guò)，目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要是兩條互補的實(shí)驗工作流程——基于凝膠的工作流程（Gel-based workflow）和基于液相色譜的工作流程（LC-based workflow）。其中對于前者而言，雙向電泳技術(shù)是核心，而這核心中的核心就是電泳的第一步：蛋白樣品制備。這是因為不像雙向電泳的其它過(guò)程有儀器，有大致相似的操作程序，蛋白樣品由于其結構特性各異，又必須使其完全溶解和盡可能少的化學(xué)修飾，所以不可能有一個(gè)通用的技術(shù)，只能通過(guò)大量的實(shí)驗來(lái)積累經(jīng)驗。正如開(kāi)篇所引用的兩句話(huà)中包含的深意：在研究蛋白的過(guò)程中，既需要嚴謹的技術(shù)流程，規范的操作手段來(lái)確保蛋白研究的完整性，也需要將其看成是獨特而奇妙的個(gè)體，結合以往經(jīng)驗但又不拘泥于經(jīng)驗，才能真正揭開(kāi)她神秘的面紗。
為什么要進(jìn)行樣品制備
“為什么要進(jìn)行樣品制備？電泳的目的不就是分離嗎？”剛接觸雙向電泳的小菜鳥(niǎo)有可能就會(huì )這么問(wèn)。這個(gè)問(wèn)題很好回答，這是由于目前雙向電泳一般只能分辨到1000-3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(spot)，而樣品中的蛋白種類(lèi)可達到10萬(wàn)種以上，因此樣品的制備是必須的。另外比如像對臨床組織樣本進(jìn)行研究，尋找疾病標記的蛋白質(zhì)組學(xué)研究目的，由于臨床樣本都是各種細胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一，如腫瘤組織中，發(fā)生癌變的往往是上皮類(lèi)細胞，而這類(lèi)細胞在腫瘤中總是與血管、基質(zhì)細胞等混雜。所以常規采用的癌和癌旁組織或腫瘤與正常組織進(jìn)行差異比較，實(shí)際上是多種細胞甚至組織蛋白質(zhì)組混合物的比較，而蛋白質(zhì)組研究的通常是單一的細胞類(lèi)型，因此需要進(jìn)行有效的樣品制備。
但是為什么要進(jìn)行不同步驟的樣品制備呢？這不僅僅是由于蛋白本身不同，所以需要不同方法來(lái)配合，而且在制備樣品的時(shí)候，首先需要明確的是什么是實(shí)驗的最終目的：是分離盡可能多的蛋白還是分離樣品中某些感興趣的蛋白，這些直接決定了你的制備方法，也決定了實(shí)驗的成功與否。由于想要分離的蛋白必須是完全溶解的，溶解的效果取決于裂解、破碎、沉淀、溶解的過(guò)程以及去污劑的選擇和各種溶液的組成，因此如果是只對樣品中的一部分蛋白感興趣，可采取預分離的方法，如欲分析的蛋白來(lái)自細胞器（細胞核、線(xiàn)粒體和原生質(zhì)膜），則應先采取超速離心或其他方法將細胞器分離出來(lái)再溶解蛋白；如果是希望分離出盡可能多的蛋白，比如進(jìn)行全蛋白質(zhì)組分析，則可以將細胞或組織中的蛋白分成幾部分，分級制備。
樣品制備的原則
應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現性。
防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。
防止在樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。
完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。
盡量去除起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。
以上這五項原則是根據北大人類(lèi)疾病研究中心講座內容改編而來(lái)，基本上可以說(shuō)是囊括了樣品制備過(guò)程中的抽象注意事項，之后還會(huì )提到具體的注意事項。
樣品制備流程
蛋白樣品制備過(guò)程簡(jiǎn)而言之就是三步：破碎、沉淀蛋白和去除雜質(zhì)。雖然說(shuō)出來(lái)不過(guò)寥寥的十個(gè)字，但是這幾個(gè)過(guò)程經(jīng)過(guò)這么多年，還沒(méi)有那位研究人員可以說(shuō)自己已經(jīng)完全掌握，面對任何蛋白制備手到擒來(lái)。
破碎——最小限度的減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原則
樣品制備的第一步當然是細胞或者其它樣品的破碎，這一步看似簡(jiǎn)單，但是操作中一旦方法不當，就有可能會(huì )丟失樣品中的蛋白和導致蛋白被修飾。要想毫發(fā)無(wú)損的通過(guò)這一關(guān)，首先就要分析樣品的來(lái)源，是易碎的細胞還是堅硬的組織？是植物細胞還是真菌？要做到有的放矢，才能事半功倍。
破碎的方法有許多種，包括循環(huán)凍融法、滲透法、去污劑法、酶裂解法、超聲波法、高壓法、液氮研磨法、機械勻漿法和玻璃珠破碎法等（可以歸納為機械法、化學(xué)法和物理法），這些方法有不同的應用范圍，但基本的原則都是要以最小的限度減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解，這也就是在樣品制備破碎這一步的關(guān)鍵所在。
就這些方法具體而言，選擇的時(shí)候如果是較易破碎的細胞組織，就可以采用滲透法，這種方法十分溫和，適用于血細胞和組織培養細胞。而對于細菌細胞，則可以采用凍融法，利用液氮一次或者多次反復凍融來(lái)裂解細胞。去污劑法適用于組織培養細胞，將樣品懸浮于含有去污劑的裂解液中，可以溶解細胞膜釋放內含物，如果裂解液中含有SDS，為了不干擾等電聚焦，可以將裂解的樣品用含有過(guò)量的非離子或者兩性離子去污劑的溶液稀釋?zhuān)蛴帽恋矸ㄈコ齋DS。另外酶裂解法適用于植物組織、細菌和真菌細胞。
除了這幾種較溫和的方法，一些較劇烈的方法也有自己的適用范圍，如超聲波法適用于細胞懸浮液，高壓法常用于有細胞壁的微生物，研磨法適用于微生物和組織，而機械勻漿法是機體軟組織破碎最常用的方法之一，玻璃珠破碎法則用于細胞懸浮液和微生物的破碎。
為了確保在這些方法過(guò)程中減少熱量的產(chǎn)生，可以在低溫（冰浴或者液氮）下操作，并且由于在破碎過(guò)程中會(huì )產(chǎn)生蛋白酶，使蛋白水解，因此也要注意在含有蛋白酶抑制劑的裂解液中進(jìn)行。
沉淀蛋白 ——可溶性是關(guān)鍵
一般而言，在破碎樣品獲得蛋白之后常常需要通過(guò)蛋白沉淀去除干擾物質(zhì)和濃縮樣品，在這個(gè)步驟中重點(diǎn)是要獲得可以重新溶解的蛋白，因此對所研究的具體蛋白的特性需要有詳細的掌握，這也是體現研究人員工作能力的“check points”。
常見(jiàn)的蛋白沉淀方法有以下幾種
沉淀方法
原理
方法
優(yōu)點(diǎn)
缺點(diǎn)
硫酸銨沉淀法
高鹽濃度的緩沖液促進(jìn)蛋白聚合沉淀
在蛋白終濃度大于1mg/mL并含有EDTA的緩沖液（>50mmol/L）將硫酸銨加至飽和，攪拌10-30分鐘，離心分離
預分離
不能得到全部蛋白，并且殘留的硫酸銨和核酸會(huì )影響等電聚焦
三氯醋酸（TCA）沉淀法
在蛋白溶液中加入TCA，使其終濃度為10%-20%，冰浴30分鐘。
被沉淀的蛋白難再溶解，并且長(cháng)時(shí)間將樣品置于這種低pH溶液中會(huì )引起蛋白降解和修飾
丙酮沉淀法
在蛋白溶液中加入3倍體積的預冷丙酮，20℃沉淀2小時(shí)，離心收集蛋白。
TCA-丙酮沉淀法
用含20mmol/L DTT或0.07%β-巰基乙醇的10%TCA溶液20℃沉淀45分鐘以上，離心收集，再用20mmol/L DTT 0.07%β-巰基乙醇清洗，空氣（冷凍）干燥。
雙向電泳常用方法
醋酸銨沉淀法
用醋酸銨的甲醇溶液沉淀，再用酚抽提，0.1mol/L甲醇清洗，再用丙酮清洗。
適用含有大量干擾物質(zhì)的植物樣品
步驟繁瑣
去除雜質(zhì) ——關(guān)鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾
在樣品中常常會(huì )含有像核酸、多糖、去污劑和代謝物等非蛋白質(zhì)雜質(zhì)，需要去除，否則會(huì )影響雙向電泳的結果，這個(gè)過(guò)程有時(shí)會(huì )造成蛋白的丟失以及蛋白的化學(xué)修飾和解聚，特別是后者會(huì )導致雙向電泳圖譜中蛋白點(diǎn)的增多（由于電荷的改變），所以操作中要多加注意。
1. 核酸的清除
