----新加麻黃附子細辛湯對小鼠Lewis原位肺癌的治療作用
姚靜靜，杜振華，李自波，杜鋼軍河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所
摘 要: 〔目的〕觀(guān)察新加麻黃附子細辛湯對小鼠 Lewis 原位肺癌是否有治療作用?！卜椒ā矻ewis 肺癌細胞滴氣管建立小鼠 Lewis 原位肺癌模型，次日用新加麻黃附子細辛湯(麻黃∶細辛∶附子∶半夏 = 1∶ 2∶2∶ 5) 灌胃開(kāi)始治療， 觀(guān)察各組小鼠的生存狀態(tài)、腫瘤數目及致瘤率;HE 染色法觀(guān)察肺病理變化?！步Y果〕用 Lewis 肺癌細胞滴氣管建立的 Lewis 原位肺癌模型 8 周后致瘤率為 91% ，腫瘤數目平均為 17 ± 3． 05;新加麻黃附子細辛湯在相同時(shí)間內致瘤率為 69% ，腫瘤數目平均為 12 ± 1． 53。HE 染色結果表明:正常組小鼠肺部切片未見(jiàn)癌細胞;模型組小鼠肺組織間聚集有片狀核大深染的腫瘤細胞，出現明顯癌變，細胞核與細胞質(zhì)比例失常，細胞核密集， 空洞逐漸變小;新加麻黃附子細辛湯組細胞核密集區相對較少。與模型組比較，新加麻黃附子細辛湯組體質(zhì)量明顯上升， 攝水食量增加， 自主活動(dòng)增多， 精神狀態(tài)良好?！步Y論〕新加麻黃附子細辛湯能夠延長(cháng) Lewis 原位肺癌模型小鼠的生存時(shí)間，對小鼠 Lewis 原位肺癌具有治療作用。
肺癌是一種嚴重威脅人類(lèi)健康和生命的疾病，其臨床表現復雜，難以早期發(fā)現，對其綜合治療的機會(huì )變?。?］ 。 隨著(zhù)中醫藥的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的中藥可以用于抗腫瘤治療，改善癥狀，提高腫瘤患者生存質(zhì)量。中醫中藥作為肺癌的輔助治療，是目前臨床肺癌治療中不可或缺的重要部分［2］ 。
目前，在肺癌的動(dòng)物實(shí)驗中大多使用小鼠皮下種植肺癌細胞系，在皮下形成肺癌腫瘤結節的動(dòng)物模型，如孫秋艷等［3］ 用體外培養的 Lewis細胞懸液注射于小鼠左側腋下，形成皮下腫瘤。這種肺癌模型成瘤率高，基本可以達到 100% ，并且周期短，適合腫瘤的活性篩選和評價(jià)。但是， 皮下接種瘤脫離了原位微環(huán)境的影響，往往和臨床實(shí)際情況不符［4］。為了保證動(dòng)物模型和臨床結果的一致性，本實(shí)驗擬采用 Lewis肺癌細胞滴氣管，建立小鼠 Lewis原位肺癌模型，觀(guān)察新加麻黃附子細辛湯對肺癌的治療作用。
1 材料與儀器
1． 1 實(shí)驗細胞 小鼠 Lewis 肺癌細胞( LLC)， 購于中科院上海細胞庫。
1． 2 實(shí)驗動(dòng)物昆明小鼠，雄性，由河南省醫學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心提供。
1． 3 藥品及試劑 新加麻黃附子細辛湯制備方法:分別稱(chēng)取原藥材麻黃 10 g、細辛20 g、附子20 g、半夏50 g(即按照1∶ 2∶ 2∶ 5 進(jìn)行組方)，混合后自來(lái)水沖洗干凈，加水量沒(méi)過(guò)藥面，浸泡30min，中火煎煮，時(shí)間30min，取水煎液。重復上述過(guò)程，共煎煮 3 次。合并 3 次濾液加熱濃縮至 400mL，使水煎液濃度為10 g/kg。
試劑 包 括:體積分數為10% 的胎牛血清、DMEM 培養基、質(zhì)量分數 0． 25% 的胰酶(美國Hyclone 公司產(chǎn)品)、生理鹽水、戊巴比妥鈉、PBS 緩沖液、蘇木精、鹽酸酒精、伊紅。
1． 4 實(shí)驗儀器CO2 細胞培養箱(賽默飛世爾科技有限公司);HDL 超凈工作臺( 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);高速冷凍離心機(北京京立離心機有限公司);電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);電子體溫計(泰克曼電子儀器有限公司);YSL-1A多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀(淮北正華生物儀器設備有限公司);KD202C轉輪式切片機( 浙江金華科迪儀器設備有限公司)。
2 實(shí)驗方法
2． 1 細胞培養 將小鼠 Lewis肺癌細胞置于含體積分數 10% 的胎牛血清及 DMEM 完全培養液中， 在 37 ℃、體積分數為 5 % 的 CO2培養箱中培養，2 ～ 3 d 更換 1 次培養液，質(zhì)量分數為 0． 25% 的胰蛋白酶消化傳代。待細胞達到所需量時(shí)，顯微鏡下計數，調至所需要濃度。
2． 2 造模 先以 0． 2 mL(約 1 × 106個(gè)細胞)接種于昆明小鼠腋下，20 d 后以頸椎脫臼法處死荷瘤小鼠，體積分數為 75% 的酒精浸泡消毒，無(wú)菌條件下剝離腫瘤組織，剪碎后用預冷的無(wú)菌生理鹽水洗凈，用組織研磨器研碎，制成瘤細胞懸液，1 000r /min，5 min，離心 2 次，加入生理鹽水調整細胞濃度為 5 ×106 個(gè)/mL。體積分數 0． 5% 的戊巴比妥鈉溶液， 按 0． 1 mL /10 g 體質(zhì)量劑量對昆明小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，取上述瘤細胞懸液10 μL 滴入昆明小鼠氣管中。
2． 3 分組及給藥 造模后將 36 只昆明種雄鼠隨機分為 3 組， 每組12 只，分別為:新加麻黃附子細辛湯組(即復方組)、模型組、正常組。復方組及模型組次日開(kāi)始給藥， 復方組以 10 g/kg 灌胃給藥，2 次/d;模型組以 0． 2 mL /10 g 蒸餾水灌胃，2 次/d。正常組按正常方式飼養。
2． 4 檢測指標及方法 實(shí)驗開(kāi)始后各組動(dòng)物每周記錄體質(zhì)量、水食量、自主活動(dòng)等變化情況，以此對比小鼠的活躍程度。實(shí)驗結束后，小鼠摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，解剖分離得到肺組織，計算小鼠肺組織表面的腫瘤數目及致瘤率。
2． 5 病理檢測 小鼠處死后， 取各組小鼠肺組織用體積分數為4% 的多聚甲醛固定， 常規石蠟包埋、切片、HE 染色、乙醇脫水、透明、封片，顯微鏡下觀(guān)察肺組織病理學(xué)變化。
2． 6 統計學(xué)分析采用 SPSS18． 0 統計軟件分析處理，實(shí)驗數據以x珋± s 表示，采用單因素方差分析和 t 檢驗，P ＜0．05 表示有統計學(xué)意義。
3 實(shí)驗結果
3． 1 對小鼠體質(zhì)量變化的影響 正常組小鼠體質(zhì)量明顯增加，模型組小鼠體質(zhì)量呈逐漸減輕的趨勢小鼠狀態(tài)明顯下降，復方組小鼠體質(zhì)量相對平穩。圖 1。
3． 3 對小鼠自主活動(dòng)的影響各組小鼠的自由活動(dòng)次數隨著(zhù)試驗時(shí)間的增長(cháng)而逐漸減少，復方組小鼠的自由活動(dòng)次數雖有所下降，但是仍然較模型組高。說(shuō)明復方組小鼠比模型組精神狀態(tài)好，具有顯著(zhù)性差異。見(jiàn)圖 4。
3． 4 新加麻黃附子細辛湯對小鼠 Lewis原位肺癌腫瘤數目和致瘤率的影響
圖 5 可見(jiàn)，正常組肺組織鮮紅;Lewis 原位肺癌模型組有明顯的肺損傷，腫瘤區域較多;復方組肺組織表面比模型組腫瘤數減少。
用 Lewis 肺癌細胞滴氣管建立的 Lewis原位肺癌模型 8 周后腫瘤數目平均為 17 ±3． 05， 致瘤率為91% ;而復方組在相同時(shí)間內腫瘤數目為 12 ±1． 53，致瘤率為 69% ，具有顯著(zhù)性差異 (P ＜0．05 )。
表明新加麻黃附子細辛湯對小鼠 Lewis原位肺癌具有治療作用。
3． 5 病理學(xué)檢測結果
將各組小鼠的肺組織切片進(jìn)行 HE 染色，在顯微鏡下觀(guān)察到:正常組小鼠肺部切片未見(jiàn)癌細胞， 結構排列整齊;模型組小鼠肺組織間聚集有片狀核大深染的腫瘤細胞，出現明顯癌變，出現核裂解現象，細胞核大而清楚，核仁增大，細胞核與細胞質(zhì)比例失常，細胞核密集，空洞逐漸變小;復方組細胞核明顯小于模型組，有少量的腫瘤細胞進(jìn)入，說(shuō)明新加麻黃附子細辛湯能明顯改善 Lewis肺癌模型肺組織的病理變化。結果見(jiàn)圖 6。
4 討論
中藥復方在抗腫瘤方面發(fā)揮著(zhù)日益重要的作用，而肺癌作為最主要和最常見(jiàn)的腫瘤，許多復方已在其治療或輔助治療過(guò)程中體現出了很大的應用價(jià)值［5］ 。
寒邪是六淫邪氣之一， 與腫瘤的發(fā)病機制關(guān)系密切［6］?！秱摗分杏涊d麻黃附子細辛湯， 方中麻黃解表發(fā)汗，除太陽(yáng)表之寒邪;制附子扶陽(yáng)溫里暖少陰之里;細辛溫經(jīng)通陽(yáng)，入里佐附子溫經(jīng)通少陰，助陽(yáng)散里寒，出外助麻黃發(fā)汗溫經(jīng)解表散寒，具有扶正解表、散寒止痛的功效［7］ 。雖然麻黃附子細辛湯有較強的散寒作用，但化痰作用偏弱。為了增強化痰作用， 在麻黃附子細辛湯基礎上增加半夏，半夏具有燥濕化痰的功效，和肺癌的發(fā)病機制相吻合，諸藥合用對肺癌具有良好的治療作用。
本研究通過(guò)麻黃細辛附子湯加半夏組成的新加麻黃附子細辛湯來(lái)研究其水煎液對小鼠 Lewis原位肺癌的治療作用。研究表明，模型組小鼠的腫瘤數目和致瘤率明顯比新加麻黃附子細辛湯多，具有顯著(zhù)性差異。在生存狀態(tài)方面， 與正常組相比， 模型組小鼠體質(zhì)量下降，食欲欠佳，飲水、飲食量減少， 精神狀態(tài)不好，活動(dòng)減少。復方組比模型組體質(zhì)量明顯上升，攝水食量有所增加，精神狀態(tài)良好。HE 染色結果表明，新加麻黃附子細辛湯組肺組織間腫瘤細胞明顯比模型組少。
綜上所述， 用 Lewis 肺癌細胞滴氣管建立小鼠Lewis原位肺癌模型，具有較好的成瘤率及轉移特性。
新加麻黃附子細辛湯是治療肺癌的一個(gè)好方劑。
聯(lián)系客服
