非編碼RNA（Non-coding RNA）是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA等。非編碼RNA發(fā)揮功能的方式很多，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種細胞活動(dòng)，主要包括基因的激活和沉默，RNA的剪接、修飾和編輯，蛋白質(zhì)的翻譯等。
1.miRNA：miRNA是一類(lèi)由內源基因編碼的長(cháng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動(dòng)植物中參與轉錄后基因表達調控。每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNA也可以調節同一個(gè)基因。
圖一 miRNA成熟及作用方式（Mikhailidis DP, Athyros VG. Nat Rev Cardiol. 2014 Feb;11(2):72-4.）
miRNA過(guò)表達：將miRNA前體序列構建入病毒載體中，該載體既可用于瞬時(shí)轉染細胞，也可以包裝成病毒用于穩定株篩選和動(dòng)物水平過(guò)表達miRNA。
miRNA敲低：設計針對miRNA的TuD RNA封閉片段或海綿片段，再將該片段構建入病毒載體中。該載體除了可以直接瞬時(shí)轉染細胞用于miRNA的敲低，也可以包裝成慢病毒，用于動(dòng)物水平敲低miRNA。
miRNA靶基因預測：miRNA通過(guò)堿基互補配對的方式識別靶基因的3’UTR區，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。因此，可以將目的基因的3’UTR區域構建到含luciferase的報告基因上，通過(guò)比較miRNA過(guò)表達或inhibitor 與報告基因作用檢測熒光值的變化，判斷miRNA對靶基因的作用。再通過(guò)對3’UTR區進(jìn)行定點(diǎn)突變的方法進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。
miRNA常用數據庫：
?miRbase（http://www.mirbase.org）：miRbase 是由曼徹斯特大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)的一個(gè)在線(xiàn)的miRNA數據庫，提供包括已發(fā)表的miRNA序列數據、注釋、預測基因靶標等信息的全方位數據庫，是存儲miRNA信息最主要的公共數據庫之一。
?TargetScan（http://www.targetscan.org/）：TargetScan是通過(guò)搜索和每條miRNA種子區域匹配的保守的8mer和7mer位點(diǎn)來(lái)預測靶基因。
?TarBase（http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8%2Findex）：TarBase數據庫人工經(jīng)歷了長(cháng)達10年左右的時(shí)間去搜集了實(shí)驗驗證過(guò)的miRNA的靶基因，包括在人、小鼠、果蠅、蠕蟲(chóng)和斑馬魚(yú)中的miRNA的靶基因。
?miRWalk（http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/）：miRWalkis是一個(gè)綜合性數據庫，提供來(lái)自人類(lèi)、小鼠和大鼠的miRNA的預測信息和經(jīng)過(guò)驗證的位于其靶基因上的結位點(diǎn)。
2.lncRNA：lncRNA是長(cháng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA）的簡(jiǎn)稱(chēng)，是長(cháng)度在200-100000 nt之間的RNA分子。大多數的lncRNAs在組織分化發(fā)育過(guò)程中，都具有明顯的時(shí)空表達特異性；序列上保守性較低，只有約12%的lncRNA可在人類(lèi)之外的其它生物中找到。
根據lncRNA在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置，可以將其分為啟動(dòng)子區（promoter associated）、內含子間（intronic）、雙向（bidirectional）、正義鏈（sense）、反義鏈（antisense）、3’UTR區（3’UTR associated）、基因間（intergenic）這7種類(lèi)型。這種位置關(guān)系對于推測lncRNA的功能有很大幫助。
圖二 lncRNA分類(lèi)（Huang X, et al.Cancer Lett. 2018 Jan 28;413:94-101.）
一般來(lái)說(shuō)，lncRNA主要從以下三種層面實(shí)現對基因表達的調控：
?表觀(guān)遺傳學(xué)調控：lncRNA招募染色質(zhì)重構復合體到特定位點(diǎn)進(jìn)而介導相關(guān)基因的表達沉默。
?轉錄調控：包括如下幾種：1）lncRNA的轉錄能夠干擾臨近基因的表達；2）lncRNA能夠通過(guò)封阻啟動(dòng)子區域來(lái)干擾基因的表達；3）lncRNA能夠與RNA結合蛋白作用，并將其定位到基因啟動(dòng)子區從而調控基因的表達；4）lncRNA能夠調節轉錄因子的活性；5）lncRNA也能夠通過(guò)調節基本轉錄因子來(lái)實(shí)現調控基因的表達。
?轉錄后調控：lncRNA能夠在轉錄后水平通過(guò)與mRNA形成雙鏈的形式調控基因的表達。
lncRNA過(guò)表達：將lncRNA序列構建入病毒載體中，該載體既可用于瞬時(shí)轉染細胞，也可以包裝成病毒用于穩定株篩選和動(dòng)物水平過(guò)表達lncRNA。
lncRNA干擾：針對lncRNA設計干擾片段，再將該片段構建入病毒載體中。該載體除了可以直接瞬時(shí)轉染細胞用于lncRNA的干擾，也可以包裝成慢病毒，用于動(dòng)物水平干擾lncRNA。
lncRNA敲除：用CRISPR/Cas9技術(shù)對lncRNA進(jìn)行敲除。針對lncRNA某條片段的兩端分別設計多條sgRNA序列，實(shí)現大片段刪除，從而達到敲除的效果。將sgRNA序列構建入病毒載體中，再將Cas9序列裝入另一載體中，隨后兩種病毒同時(shí)感染目的細胞進(jìn)行敲除。
lncRNA靶基因尋找：方法基本類(lèi)似于上面表述的miRNA雙熒光素酶檢測。
3.circRNA: circRNA即環(huán)形RNA（circular RNA）的簡(jiǎn)稱(chēng)，是一類(lèi)不具有5’末端帽子和3’ 末端poly（A）尾巴、并以共價(jià)鍵形成環(huán)形結構的客觀(guān)存在于生物體內的非編碼RNA分子。
circRNA主要特征：
?circRNA由特殊可變剪切產(chǎn)生，大量存在與真核細胞的細胞質(zhì)中，主要來(lái)源于外顯子，少部分內含子來(lái)源的circRNA存在細胞核中。
?表達水平具有種屬、組織、時(shí)間特異性。
?circRNA呈閉合環(huán)狀結構，不易被核酸外切酶降解，比線(xiàn)性RNA更加穩定。
?具有一定序列保守性。
?在轉錄或轉錄后水平發(fā)揮調控作用。
?絕大多數circRNA是非編碼的，但也有少數可以翻譯為多肽。
circRNA根據其來(lái)源可分為三類(lèi)：外顯子來(lái)源的circRNA（exonic circRNAs），內含子來(lái)源的circRNA（circular intronic RNAs，ciRNAs），以及由外顯子和內含子共同組成的circRNA（retained-intron circRNAs）。
circRNA的作用機制：
?miRNA分子海綿，circRNA含有大量的miRNA結合位點(diǎn)，具有miRNA海綿作用，進(jìn)而間接調控miRNA下游靶基因的表達。
圖三 miRNA海綿機制（圖片來(lái)自網(wǎng)絡(luò )）
調控基因轉錄，circRNA也可以通過(guò)與RNA結合蛋白的結合來(lái)調控蛋白功能，比如通過(guò)與轉錄因子的結合來(lái)抑制基因的轉錄。
編碼功能，circRNA雖然屬于非編碼RNA，但是也有少數circRNA可以編碼多肽，通過(guò)該多肽行使調控功能。
circRNA過(guò)表達：同上述的lncRNA步驟類(lèi)似，但是circRNA過(guò)表達由于成環(huán)效率的影響，其難度相對普通基因的過(guò)表達更大。
circRNA干擾：同上述的lncRNA方法步驟。
circRNA敲除：同上述的lncRNA方法步驟。
circRNA靶基因尋找：同上述的miRNA和lncRNA雙熒光素酶檢測方法。
