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1ceRNA的分類(lèi)及其生物學(xué)功能
1.1假基因轉錄物作為ceRNA假基因是一類(lèi)具有與其功能基因序列相似，通常情況下不具有蛋白質(zhì)翻譯功能的基因，翻譯過(guò)程因提前終止密碼子、移碼突變、插入或缺失而中斷。假基因在基因組中一直被認為是垃圾基因，但隨著(zhù)研究的深入，發(fā)現假基因能通過(guò)多個(gè)機制促進(jìn)或抑制其同源基因的表達，增強或抑制其生物功能，其中包括假基因的轉錄物能作為ceRNA吸附miRNA。假基因的轉錄物可以作為理想的ceRNA，是由于它們具有很多與其同源基因相同的MRE。例如，許多在PTEN3′UTR上的保守MRE，也出現在PTEN的假基因PTENP1的轉錄物中，并且過(guò)表達PTENP1的3′UTR，并以Dicer依賴(lài)的方式上調PTEN的表達水平，這暗示PTENP1轉錄物通過(guò)與PTENmRNA競爭共同的miRNA，從而調節PTEN的表達。假基因的轉錄物在ceRNA調控中作為miRNA分子海綿(Sponge)，其作用可被功能化。由于假基因的同源基因可能是關(guān)鍵致病基因（如腫瘤抑制基因或癌基因），通過(guò)ceRNA調節，假基因也能在病理過(guò)程中發(fā)揮一定作用。如PTEN的假基因PTENP1，與PTEN一樣具有抑制腫瘤的特性，并在一些人類(lèi)腫瘤中選擇性缺失。對其他假基因的研究發(fā)現，過(guò)表達KRAS的假基因KRAS1P的3′UTR，能增加KRAS轉錄物的表達，并加速細胞的增殖速度，影響腫瘤的發(fā)生。對干細胞多效轉錄因子OCT4的研究發(fā)現，其假基因OCT4-pg4在肝癌中被異常激活，且其表達水平與OCT4呈正相關(guān)。由于OCT4和OCT4-pg4都能被miR-145作用，因此OCT4-pg4作為天然的miR-145海綿保護OCT4免受miR-145的作用，使OCT4的蛋白表達水平升高，從而促進(jìn)肝癌細胞的生長(cháng)和腫瘤的發(fā)生。此外，整合子復合物亞基6（Integratorcomplexsubunit6,INTS6）相關(guān)假基因INTS6P1能與INTS6競爭結合miR-17-5p，發(fā)揮抑癌作用。以上研究表明，假基因在基因組中并非無(wú)關(guān)緊要，其通過(guò)ceRNA的作用方式調節其同源編碼基因的表達，進(jìn)而在癌癥相關(guān)的病理過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)重要的作用。
1.2lncRNA作為ceRNAlncRNA是一類(lèi)長(cháng)度大于200nt、由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉錄、保守性較低的非編碼RNA，并且其轉錄物可通過(guò)多種調節機制參與生物學(xué)過(guò)程。目前已發(fā)現超過(guò)10000種lncRNA可能具有潛在的ceRNA特性，許多研究已經(jīng)證實(shí)lncRNA作為miRNA和mRNA的競爭平臺，在病理和生理相關(guān)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現，一些異常表達的疾病特異性的lncRNA通過(guò)ceRNA介導的相互作用在癌癥的進(jìn)程中產(chǎn)生深遠影響。在對lncRNA-BGL3的研究中發(fā)現，其與PTEN競爭結合miR-17、miR-93、miR-20a、miR-20b、miR-106a和miR-106b，并影響PTEN的表達水平及其下游PI3K/AKT信號通路，進(jìn)而影響B(tài)cr-Abl的轉化過(guò)程和腫瘤的生成。同樣，lncRNA-HLUC在肝癌樣本和細胞系中表達顯著(zhù)上調。對HLUC上調的多個(gè)機制研究中發(fā)現，其ceRNA特性是一個(gè)復雜的自動(dòng)環(huán)路的一部分：HLUC作為分子海綿抑制miR-372的表達和活性，從而減少miR-372對cAMP依賴(lài)性蛋白激酶A催化亞基β（cAMP-dependentproteinkinaseAcatalyticsubunitβ,PRKACB）的抑制作用，而PRKACB能誘導cAMP反應結合蛋白（cAMPresponseelementbindingprotein,CREB）的磷酸化，在肝癌中提高CREB依賴(lài)的HULC表達上調。這些研究表明，lncRNA作為ceRNA在相關(guān)信號通路和環(huán)路中發(fā)揮作用，影響癌癥的進(jìn)程。除了在癌癥進(jìn)程中的作用，lncRNA亦可作為ceRNA在一些生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。如內源性lncRNALinc-MD1以ceRNA的方式調控肌肉分化的過(guò)程。Linc-MD1能分別結合miR-133和miR-135，從而與它們的靶基因——決定因子樣蛋白-1（Mastermind-likeprotein1,MAML1）和肌細胞特異性增強因子2C（Myocyte-specificenhancerfactor2C,MEF2C）產(chǎn)生競爭性效應。在對另一個(gè)lncRNA——H19的研究中發(fā)現，其不僅作為let-7的分子海綿調節let-7的表達，而且使let-7的靶基因HGMA2和Dicer在蛋白水平表達上調。由于let-7的表達通常與細胞的分化狀態(tài)相關(guān)[，在小鼠肌源性細胞C2H2中的研究中發(fā)現H19的缺失與過(guò)表達let-7產(chǎn)生的效果一致，均可顯著(zhù)增加肌球蛋白重鏈(Myosinheavychain,MHC)和肌細胞生成素（Myogenin,MyoG）的表達，從而加速肌肉分化。以上lncRNA作為ceRNA在肌肉分化中的作用說(shuō)明lncRNA以ceRNA角色參與生長(cháng)發(fā)育調節，也可能在其他生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用。
1.3CircRNA作為ceRNACircRNA是一類(lèi)由特殊的選擇性剪切產(chǎn)生的非編碼RNA，與線(xiàn)性RNA不同的是：circRNA呈封閉環(huán)狀結構，不受RNA外切酶的影響，表達更穩定。研究表明，某些特殊的circRNA分子富含miRNA結合位點(diǎn)，在細胞中起到miRNA海綿的作用，進(jìn)而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平，是一類(lèi)高效率的ceRNA[34]。如小腦變性相關(guān)蛋白1反義鏈（Cerebellardegeneration-relatedprotein1antisense,CDR1as）包含63個(gè)保守的miR-7結合位點(diǎn)，該circRNA在細胞中和miRNA效應物密集地結合，能有效地解除miR-7對其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表達水平。在斑馬魚(yú)(Daniorerio)模型中（本身不表達CDR1as），表達CDR1as與敲除miR-7有類(lèi)似的效果，都能損傷斑馬魚(yú)中腦的發(fā)育。研究發(fā)現，miR-7作為關(guān)鍵調節因子廣泛參與癌癥途徑，如抑制在乳腺癌、膠質(zhì)瘤等癌癥中表達顯著(zhù)上調的信號激酶P21激活激酶1（P21-activatedkinase1,Pak1）的表達；miR-7也能通過(guò)作用α-突觸核蛋白（α-synuclein）編碼的mRNA3′UTR，抑制其表達。這些研究暗示CDR1as因其ceRNA特性能有效地吸附miR-7，可能是神經(jīng)元功能的調節因子，也可能是神經(jīng)系統疾病和癌癥治療的潛在靶點(diǎn)。Capel等對另一個(gè)已知環(huán)狀RNA性別決定區域Y(Sex-determiningregionY,Sry)的RNA研究發(fā)現，該RNA含有16個(gè)miR-138的結合位點(diǎn)，利用靶點(diǎn)分析實(shí)驗和免疫共沉淀實(shí)驗證實(shí)該環(huán)狀RNA能作為miR-138的分子海綿，抑制miR-138的表達。同時(shí)，Granados-Riveron等進(jìn)一步研究發(fā)現Sry的正義鏈轉錄物和其反義鏈轉錄物類(lèi)似，也能發(fā)生環(huán)化并作為miR-138的分子海綿起作用。目前結合最新生物信息學(xué)工具和相關(guān)實(shí)驗技術(shù)在基因組中發(fā)現成千上萬(wàn)種circRNA在特定組織或特定發(fā)育階段穩定表達，這暗示circRNA在基因組中的含量很豐富，并非RNA選擇性剪接產(chǎn)生的隨機物，它在一定程度上可能參與基因的表達調控。如利用RNA轉錄組測序（RNAsequence,RNA-seq）數據分析果蠅circRNA的生物合成和功能，發(fā)現其circRNA上含有大量保守的miRNA結合位點(diǎn)。結果顯示circRNA作為潛在的高效ceRNA分子，對其進(jìn)一步的生物學(xué)功能研究具有重要意義。以上非編碼RNA作為ceRNA及其生物學(xué)功能見(jiàn)表2。
2ceRNA的調節
目前，許多研究已表明ceRNA之間的相互作用，但對于哪些因素可能會(huì )影響某個(gè)RNA分子發(fā)揮其ceRNA功能仍不清楚。我們推測構成ceRNA調控網(wǎng)絡(luò )的各個(gè)組分的數量級、RNA3′UTR的變化以及RNA結合蛋白（RNAbindingprotein,RBP）的作用都有可能對ceRNA構成的調控網(wǎng)絡(luò )產(chǎn)生重要的影響。
2.1ceRNA、miRNA和MRE的數量ceRNA和miRNA的表達水平會(huì )影響ceRNA網(wǎng)絡(luò )的交互作用。當總的轉錄物數量遠遠超過(guò)miRNA數量時(shí)，整體的ceRNA關(guān)系很弱，因為只有數量有限的miRNA起抑制作用。相反，當miRNA的數量遠大于ceRNA分子數量時(shí)，交互作用不太可能發(fā)生，因為轉錄物都處于被抑制的狀態(tài)。因此，交互調節可能發(fā)生在一個(gè)所有ceRNA和miRNA數量在近似數量級的網(wǎng)絡(luò )中。Kumar等利用RNA-seq分析得到HMGA2和TGFBR3的轉錄物表達水平相似，并且共同結合的let-7家族成員的總表達水平與HMGA2和TGFBR3的表達水平在一個(gè)數量級，這進(jìn)一步用實(shí)驗證明最佳的ceRNA對話(huà)可能發(fā)生在miRNA與ceRNA轉錄物豐度一致的情況下。此外ceRNA間共同的MRE數量也會(huì )影響ceRNA調節。為了驗證這一假設，Ala等[44]構建了一個(gè)實(shí)驗模型：該模型由10個(gè)ceRNA和10個(gè)miRNA共同組成，但并不是所有的ceRNA都能被這10個(gè)miRNA作用。研究發(fā)現，當增加其中某一個(gè)特定ceRNA表達時(shí)，含有更多MRE的RNA表達會(huì )顯著(zhù)上升，而對于不含有共同MRE的其他RNA則幾乎沒(méi)有作用。由此說(shuō)明單個(gè)RNA所含MRE的數量也可能決定其在ceRNA調控網(wǎng)絡(luò )中的作用。
2.23′UTR的變化目前對于ceRNA的研究主要是基于miRNA作用于RNA的3′UTR而引發(fā)的分子間競爭所導致的相互調控。因此，RNA分子3′UTR的變化會(huì )影響ceRNA調控。研究發(fā)現，RNA剪接和聚腺苷酸化這兩個(gè)過(guò)程會(huì )影響RNA的3′UTR。RNA的剪接會(huì )影響分子的穩定性也會(huì )減少或增加3′UTR上miRNA的結合位點(diǎn)，聚腺苷酸化常使編碼基因轉錄出更短的3′UTR。對于3′UTR變短的轉錄物，一方面，直接靶向它的miRNA會(huì )減少；另一方面，它作為ceRNA調節其他轉錄物的能力也將減弱。Mayr等在研究中發(fā)現，3′UTR變短的轉錄物上一些miRNA的結合位點(diǎn)消失。miRNA既可以使mRNA降解，也可以抑制mRNA的翻譯。在不同組織和基因間的實(shí)驗發(fā)現，3′UTR變短的轉錄物的穩定性更強，并且編碼更多的蛋白質(zhì)。因此，無(wú)論是3′UTR上序列的變化還是長(cháng)度的變化，都可能影響ceRNA發(fā)揮其功能。
2.3RBP與miRNA間的相互影響RBP在許多轉錄后過(guò)程中起著(zhù)重要作用，包括影響RNA剪接、穩定性、轉運和翻譯。RNA間除了相互競爭共同的miRNA，也可能競爭共同的RBP。這兩個(gè)調節過(guò)程可能不是分開(kāi)的，它們之間也存在著(zhù)內在的聯(lián)系[17]。RBP不僅與miRNA通過(guò)競爭或合作結合特異性位點(diǎn)影響它們靶向的mRNA表達，還可能由于RBP的結合導致RNA二級結構的改變，從而改變了miRNA的結合位點(diǎn)。由于RBPHuR發(fā)現得較早，在這方面的研究較多。研究發(fā)現RBPHuR和miRNA之間的競爭通常能增強基因的表達，如HuR分別與miR-122、miR-548c、miR-494、miR-16和miR-331-3p競爭結合陽(yáng)離子氨基酸轉運蛋白1、拓撲異構酶Ⅱα(TopoisomeraseIIalpha,TOP2A)、核仁素（Nucleolin,NCL）、環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase-2,COX2）和ERBB2的mRNA，抑制相應miRNA作用于這些mRNA，從而促進(jìn)mRNA合成；而HuR和miRNA間的結合通常降低它們靶向mRNA的表達，如HuR能作用C-MYCmRNA3′UTR，上調其表達，但當HuR與let-7的RNA誘導的沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）作用時(shí)，會(huì )抑制C-MYC的表達[56]。上述研究說(shuō)明，RBP可能通過(guò)與miRNA相互影響，進(jìn)而在ceRNA網(wǎng)絡(luò )產(chǎn)生影響。
3結語(yǔ)
目前ceRNA的研究仍然處于起步階段，每種ceRNA的類(lèi)型如假基因轉錄物、lncRNA、circRNA等的研究例子都較少。一方面需要發(fā)現更多類(lèi)型的ceRNA，另一方面需要探索ceRNA交叉對話(huà)是否是一個(gè)普遍的、大型的RNA轉錄調控網(wǎng)絡(luò )[17]。ceRNA的預測是限制其研究的主要影響因素，改進(jìn)預測策略將有助于發(fā)現更多的ceRNA。與紫外交聯(lián)免疫沉淀高通量測序（High-throughputsequencingofRNAisolatedbycrosslinkingimmunoprecipitation,HITS-CLIP）和光激活性增強的核糖核苷交和免疫共沉淀（Photoactivatable-ribonucleoside-enhancedcrosslinkingandimmunoprecipitation,PAR-CLIP）等一些新的技術(shù)結合將優(yōu)化在全基因組范圍內預測ceRNA。另外，如果ceRNA的預測不局限在典型的轉錄物3′UTR的MRE，也能提高ceRNA的預測范圍。最近研究表明，miRNA的調節作用并不限制在轉錄物的3′UTR，也可能在轉錄物的編碼區或5′UTR。此外，目前對ceRNA的研究都在兩個(gè)RNA之間，而越來(lái)越多的研究表明ceRNA交叉對話(huà)是一個(gè)大型的調控網(wǎng)絡(luò )。除了直接通過(guò)共有的miRNA引起的相互作用，非直接的相互作用對ceRNA調控也可能產(chǎn)生深遠的影響。未來(lái)對ceRNA的研究應該不局限于發(fā)現二元ceRNA交互作用，也應該分析潛在的交織的miRNA與ceRNA網(wǎng)絡(luò )。雖然目前對ceRNA網(wǎng)絡(luò )的研究還不夠成熟，但RNA-miRNA-RNA作為一個(gè)新的、在轉錄后水平以競爭性?xún)仍吹恼{節方式調控基因的機制，可應用于生物學(xué)過(guò)程的系統研究，為疾病的研究和治療提供新方法。
作者：李靜秋 楊杰 周平 樂(lè )燕萍 龔朝輝 單位：寧波大學(xué)醫學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所 浙江省病理生理學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗室
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