研究人員頭一回在一個(gè)分子內部以三維圖像的形式直接捕獲原子的模糊輪廓！實(shí)現了上述創(chuàng )舉的冷凍電鏡還有望揭開(kāi)更多生物進(jìn)程的奧秘。
1.2 埃：這是該圖像的分辨率。也就是說(shuō)，它能顯示的細節精度達 0.12 納米，逼近最小的原子，即氫原子的直徑！圖中出現了去鐵鐵蛋白大分子中的碳、氧、氮等原子。在原子級分辨率冷凍電鏡出現之前，這些細節只能通過(guò) X 射線(xiàn)晶體學(xué)方法重建。
前頁(yè)這張照片得到了業(yè)內人士的一致贊賞。
我們可以看到，這是一個(gè)存在大量分支的球狀物，上面裝飾著(zhù)去鐵鐵蛋白（血液中的鐵轉運蛋白）的大分子，甚至可以從中解析最小的原子——電子顯微鏡首次達到1.2埃（0.12納米）的原子級分辨率！
“這是蛋白質(zhì)顯微結構研究領(lǐng)域的一個(gè)巨大飛躍?！卑屠杈C合理工學(xué)院生物化學(xué)家、電子顯微鏡專(zhuān)家皮埃爾-達米安·庫勒（Pierre-Damien Coureux）歡呼道。德國馬普生物物理化學(xué)研究所的霍爾格·施塔克（Holger Stark）是實(shí)現該突破的主角之一，他認為“提高分辨率的終極障礙已被克服”。
其實(shí)，人們早已“見(jiàn)過(guò)”原子了：1950年代起，X射線(xiàn)晶體學(xué)就實(shí)現了原子的可視化。然而，這只是一種間接方法：通過(guò)對X射線(xiàn)照射樣品創(chuàng )建的衍射圖像進(jìn)行處理和解釋?zhuān)芯咳藛T可重建樣品的分子結構。
此外，該技術(shù)只能用于可形成晶體的化學(xué)物質(zhì)的研究，也就是那些原子排列規則的固體——盡管大多數礦物（鹽、水……）都滿(mǎn)足此要求，但許多活性分子（例如蛋白質(zhì)）卻是不規則的。
最后，X射線(xiàn)晶體學(xué)的最大不足就是缺乏強制冷凍蛋白質(zhì)的技術(shù)。
重現分子運動(dòng)
然而，蛋白質(zhì)分子的主要特征是“極易彎曲，始終處于運動(dòng)狀態(tài)”，雅克·杜博歇（Jacques Dubochet）評論道。
因發(fā)展了冷凍電鏡技術(shù)，這位瑞士洛桑大學(xué)榮譽(yù)教授與美國哥倫比亞大學(xué)的約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）、英國劍橋大學(xué)的理查德·亨德森（Richard Henderson）榮膺2017年諾貝爾化學(xué)獎。
阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）
40年前，杜博歇在觀(guān)察蛋白質(zhì)的自然排列時(shí)發(fā)明了冷凍電鏡。他找到了一種將蛋白質(zhì)封入“玻璃態(tài)水”（低密度無(wú)定形冰）中而凍結其運動(dòng)的方法：人們由此觀(guān)察到了蛋白質(zhì)與細胞質(zhì)發(fā)生相互作用時(shí)的千姿百態(tài)。“如今，冷凍電鏡的分辨率真的已經(jīng)達到原子級?！边@位已退休的研究人員自豪地總結道。
懸于低密度無(wú)定形冰中的 GroEL 蛋白。在水中純化蛋白質(zhì)，然后將一片穿孔的膜浸入該蛋白質(zhì)溶液，從而使蛋白質(zhì)在其孔隙中伸展并充分勾勒出自身結構。最后，將所有物質(zhì)浸入 -182℃的液態(tài)乙烷中?？焖俚睦鋮s過(guò)程使水以玻璃態(tài)凝結，如同一塊保護性的脈石般包裹著(zhù)蛋白質(zhì)。
低溫顯微鏡之所以必然是電子顯微鏡，是因為只有電子才能顯示出原子的輪廓，而光學(xué)顯微鏡中的可見(jiàn)光會(huì )繞過(guò)原子導致無(wú)法顯像。傳統共聚焦顯微鏡使用的可見(jiàn)光只能分辨間距不短于自身半個(gè)波長(cháng)的兩個(gè)相鄰點(diǎn)，因此充其量只能區分200納米的細節。
然而，原子的大小在0.1到1埃之間，是傳統光學(xué)顯微鏡分辨率的萬(wàn)分之一！波長(cháng)短得多的電子束的尺寸能達到0.02埃。而電子顯微鏡的缺點(diǎn)在于，電子束帶有負電荷，會(huì )與樣品發(fā)生相互作用并切斷有機分子鍵，從而降低成像效果！
這是電子顯微鏡的經(jīng)典技術(shù)：向樣品發(fā)射電子束，電子束透過(guò)樣品照射到閃爍體探測器上并發(fā)出光子，繼而被 CCD 相機檢測到。然而2013 年，能夠直接檢測電子的新型照相機徹底改變了這一過(guò)程。
另外，電子也非常敏感，任何干擾都會(huì )影響其運動(dòng)。因此，只有當研究對象是純凈的化學(xué)物質(zhì)且處于真空環(huán)境中，電子顯微鏡才能得到準確的圖像。然而在真空環(huán)境中，蛋白質(zhì)會(huì )被破壞。
因此迄今為止，蛋白質(zhì)的透射電子顯微鏡圖像一直都類(lèi)似于半融化的蠟雕。長(cháng)期以來(lái)，上述研究一直被批評者嘲諷為“斑點(diǎn)學(xué)”！
所幸近年來(lái)，難題已被一一解決：杜博歇將蛋白質(zhì)固定在玻璃態(tài)水中的方法進(jìn)行改進(jìn)，可以防止蛋白質(zhì)被電子和真空破壞；極細電子束的開(kāi)發(fā)進(jìn)一步減少了蛋白質(zhì)的損壞，超精確相機實(shí)現了單電子探測，若干新算法還校正了光學(xué)像差和其他畸變。
更重要的是，如今超級計算機的強大性能可以對收集于單個(gè)樣本的成千上萬(wàn)張圖像進(jìn)行合成，從而展現出無(wú)與倫比的精確度。
要看清原子，僅靠一張照片是不夠的：相機從數百個(gè)角度記錄下數千張圖像來(lái)獲取三維結構，并且記錄了樣品中成千上萬(wàn)的分子。將所有數據合成單幅圖像需要數周的計算。最重要的是，還需要一種基于化學(xué)結構和化學(xué)鍵排列方向概率的強大算法，來(lái)提高圖像精度。如今，這些程序甚至能夠區分樣品分子采用的各種構象
水到渠成。2020年5月，馬普研究所霍爾格·施塔克團隊，以及劍橋大學(xué)MRC分子生物學(xué)實(shí)驗室的舍爾斯·謝雷斯（Sjors Scheres）和拉杜·阿里切斯庫（Radu Aricescu）團隊于同一天宣布實(shí)現了原子級分辨率。
這是人類(lèi)首次分辨出分子中的原子！無(wú)巧不成書(shū)，這兩個(gè)團隊研究的是同一個(gè)大分子，即去鐵鐵蛋白。對致力于將冷凍電鏡分辨率推向極限的結構生物學(xué)家來(lái)說(shuō)，這種將鐵轉運到血紅蛋白的蛋白質(zhì)確實(shí)是一種理想的試驗品。
“這是一個(gè)非常穩定且對稱(chēng)的大分子?！鄙釥査埂ぶx雷斯解釋說(shuō)，“我們甚至通過(guò)冷凍電鏡看到了單個(gè)氫原子?！?/p>
“幾年來(lái)，我們對化學(xué)物質(zhì)的感知已經(jīng)從顯示化學(xué)物質(zhì)的大概形態(tài)，發(fā)展到了原子級別的觀(guān)察?！逼ぐ?達米安·庫勒描述道，“這改變了生物學(xué)的一切?！?/p>
事實(shí)上，生命的活動(dòng)建立于原子間的精妙相互作用：異性電荷相吸，同性電荷相斥，蛋白質(zhì)像多極化的磁體一樣與受體結合。由此實(shí)現了諸如神經(jīng)元之間的信息傳遞，病毒入侵細胞，藥物阻斷有害效應……
核糖體的完整翻譯過(guò)程
“今后我們將能看到在活體環(huán)境中的蛋白質(zhì)，觀(guān)察它們在與受體相互作用時(shí)是如何改變構象的?！比鹗堪腿麪柎髮W(xué)的菲利普·蘭格萊（Philippe Ringler）興奮地表示，他正目睹冷凍電鏡勢不可擋的浪潮，“許多晶體學(xué)家在接受冷凍電鏡的操作培訓，而各所大學(xué)也開(kāi)始逐步配備強大的成像設備?！?/p>
微管是如何在細胞內轉運元素的？核糖體（上圖）是如何翻譯基因組的？線(xiàn)粒體是如何吞吐維持其機能所需的物質(zhì)的？今后，生物學(xué)家將借助電鏡看到運轉中的細胞工廠(chǎng)。
得益于該技術(shù)，2020年7月，美國馬薩諸塞大學(xué)的一個(gè)團隊從基因組的編碼入手，準確地描繪出細胞內蛋白質(zhì)是如何“編織”在一起的。
在冷凍電鏡下放置了一些核糖體后，研究人員觀(guān)察到，這些由蛋白質(zhì)和RNA組成的結構通過(guò)折疊成精確的構型，形成若干空腔并在腔內插入了不同的部件：確保準確翻譯的基因組片段，以及將要組裝的蛋白質(zhì)載體。隨著(zhù)翻譯的進(jìn)行，這些部件從一個(gè)腔傳遞到另一個(gè)腔。在前所未有的精度下，整個(gè)過(guò)程宛如一場(chǎng)由眾多分子共同扭動(dòng)的芭蕾舞！
除此以外，還有更多利用冷凍電鏡原子級分辨率的研究正在開(kāi)展中。例如，通過(guò)識別出最適合嵌入受體的分子來(lái)加速藥物或疫苗的開(kāi)發(fā)。在鑒別出COVID-19后的頭一個(gè)月，數十個(gè)團隊就制取了若干該病毒的冷凍電鏡圖像來(lái)觀(guān)察其表面的分子，從而了解其附著(zhù)在人類(lèi)細胞中的具體位置。
隨后，這些圖像可以幫助研究人員更快地識別出能夠阻止病毒附著(zhù)、預防感染的候選藥物。還有研究試圖通過(guò)觀(guān)察神經(jīng)遞質(zhì)附著(zhù)在膜受體上的過(guò)程，將神經(jīng)信號在神經(jīng)元間傳遞的過(guò)程可視化。
這樣一來(lái)就可以制造出針對癲癇、疼痛或戒斷發(fā)作的靶向藥物。還有的研究希望能夠解釋在阿爾茨海默病患者的大腦中積聚的斑塊（參見(jiàn)下方圖示）……
阿爾茨海默病是由大腦中的淀粉樣沉積物所引起的，這些淀粉樣斑塊由蛋白質(zhì)塊組成。解密其與腦細胞的相互作用以及它們在腦中的蔓延方式或許會(huì )開(kāi)發(fā)新的治療途徑。
這只是冷凍電鏡原子革命的開(kāi)始，卻也可以認為是一個(gè)完美的結束，因為該技術(shù)的分辨率幾乎無(wú)法再提高了?！拔艺J為冷凍電鏡的分辨率能達到1.1甚至1埃?！鄙釥査埂ぶx雷斯預測道，“不過(guò)為此糾正像差需要處理海量的數據?！?/p>
目前，研究人員的目標是將原子級分辨率擴展到比去鐵鐵蛋白更復雜的分子。2020年初，冷凍電鏡三維分子結構數據庫已建檔10000組數據。在理查德·亨德森看來(lái)，到2024年，冷凍電鏡技術(shù)產(chǎn)生的研究數據或許會(huì )比X射線(xiàn)晶體學(xué)更多。
化學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)全新局面正徐徐打開(kāi)。
撰文 Anne Debroise
編譯 周玉府
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