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10月5日，2017年諾貝爾化學(xué)獎揭曉，在“冷凍電鏡（cryo-electron microscopy）”領(lǐng)域做出卓越貢獻的三位生物物理學(xué)家分享了這項殊榮，他們是瑞士洛桑大學(xué)的Jacques Dubochet教授、美國哥倫比亞大學(xué)的Joachim Frank教授、英國劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗室Richard Henderson教授。
Jacques Dubochet教授、Joachim Frank教授、Richard Henderson教授
Jacques Dubochet，1942年出生于瑞士Aigle，1973年于日內瓦大學(xué)和瑞士巴塞爾大學(xué)獲得博士學(xué)位，后任教于瑞士洛桑大學(xué)。
Joachim Frank，1940年出生于德國錫根，1970年于德國慕尼黑工業(yè)大學(xué)獲得博士學(xué)位，現任教于美國哥倫比亞大學(xué)。
Richard Henderson，1945年出生于蘇格蘭愛(ài)丁堡，1969年于劍橋大學(xué)獲得博士學(xué)位，現任職于劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗室。
冷凍電鏡為什么會(huì )獲得諾獎？
諾獎委員會(huì )給出的獲獎理由原話(huà)是“for developing cryo-electron microscopy for the high-resolution structure determination of biomolecules in solution”，這句話(huà)已經(jīng)概括了冷凍電鏡（通?？s寫(xiě)為Cryo-EM）的意義，讓科學(xué)家們能高效率地以原子級分辨率獲得生物分子的三維結構。
俗話(huà)說(shuō)的好，“一圖勝千言”，可視化的生物分子結構一方面幫助科學(xué)家更好地理解這些分子的生物學(xué)功能，另一方面對于藥物研發(fā)具有重要的指導意義。
下面是近些年幾個(gè)依靠冷凍電鏡獲得的生物大分子結構，包括獲得今年諾貝爾生理學(xué)或醫學(xué)獎的控制“晝夜節律”的蛋白質(zhì)復合物（下圖a），與聽(tīng)覺(jué)相關(guān)的壓力變化傳感器（下圖b），以及寨卡病毒（下圖c）。這些結構，依靠之前的結構生物學(xué)研究技術(shù)根本不可能獲得。
近些年幾個(gè)依靠冷凍電鏡獲得的生物大分子結構
什么是冷凍電鏡？
說(shuō)到分子結構，大部分化學(xué)和材料學(xué)研究者都會(huì )想起X-射線(xiàn)晶體學(xué)和核磁共振（NMR）。的確，過(guò)去的相當長(cháng)一段時(shí)間，蛋白質(zhì)結構的解析也一樣需要依靠X-射線(xiàn)晶體學(xué)和核磁共振。在已解析的一千多種膜蛋白結構當中，90%以上都采用的是X射線(xiàn)晶體學(xué)方法，核磁共振在小分子量的蛋白質(zhì)結構解析中也發(fā)揮了重要的作用。
然而，這兩種方法都面臨不少限制。NMR僅適用于相對較小的蛋白質(zhì)；X射線(xiàn)晶體學(xué)需要目標分子能形成高質(zhì)量的晶體，就算這樣也只能得到結晶態(tài)分子的結構，而無(wú)法反映生物分子的動(dòng)態(tài)變化。郁悶的是，相當數量的生物分子無(wú)法形成良好的晶體，這讓很多結構生物學(xué)研究者欲哭無(wú)淚。
電鏡在被發(fā)明之后的很長(cháng)一段時(shí)間之內，都無(wú)法用于生物材料的結構表征，電鏡的電子束能量高，而且操作要求真空和脫水，這些讓脆弱的生物分子無(wú)法承受。
1968年，英國劍橋MRC分子生物學(xué)實(shí)驗室的Aaron Klug博士等人利用電子顯微鏡照片重構噬菌體三維結構，提出了電鏡三維重構技術(shù)。Klug博士也因發(fā)展晶體電子顯微鏡方法而獲1982年諾貝爾化學(xué)獎。1974年，加州大學(xué)伯克利分校的Robert Glaeser教授和他學(xué)生Kenneth A. Taylor首次提出了冷凍電鏡技術(shù)，成功實(shí)現了冷凍含水生物樣品的電鏡成像，在超低溫條件下可有效降低電子輻射對冰凍樣品的結構破壞并可維持高真空度。
冷凍電鏡的基本原理就是先把樣品冰凍，然后保持超低溫進(jìn)入電子顯微鏡，高度相干的電子照射樣品，電子穿透樣品和附近的冰層并被散射，探測器和透鏡系統將散射信號轉換為放大的圖像并記錄下來(lái)，最后進(jìn)行三維重構，從二維圖像通過(guò)計算得到樣品的三維結構。盡管在超低溫的條件下，電子帶來(lái)的輻射損傷被有效地控制到一定程度，但由于脆弱的生物分子樣品所能承受的輻射劑量有限，導致檢測的信噪比很低。另外，隨著(zhù)觀(guān)測的進(jìn)行，額外的電子會(huì )累積而造成分子的移動(dòng)，導致獲得的圖像變得模糊。簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō)，最初冷凍電鏡的分辨率比較低，只能用來(lái)分析相對較大的樣品結構，比如病毒顆粒。
1975年，Richard Henderson教授等人在Klug博士工作基礎上通過(guò)電子顯微鏡獲得膜蛋白細菌視紫紅質(zhì)（bacteriorhodopsin）的三維結構，分辨率達到了7 ?（下圖a），這在當時(shí)已經(jīng)是很了不起的成就，但與X射線(xiàn)晶體學(xué)能提供的3 ?分辨率相比，還是顯得相當粗糙。Henderson教授顯然并不滿(mǎn)足，隨著(zhù)電子顯微鏡技術(shù)以及樣品冷凍技術(shù)的發(fā)展，15年后的1990年，他終于通過(guò)冷凍電鏡技術(shù)獲得了第一張分辨率在原子級別的蛋白質(zhì)結構圖像（下圖b）。這一工作證明冷凍電鏡一樣可以像X-射線(xiàn)晶體學(xué)那樣提供高分辨率的生物分子結構信息。
細菌視紫紅質(zhì)結構的對比
但結構規整的細菌視紫紅質(zhì)的成功在某種程度上只能算是一個(gè)例外，如何才能將這一技術(shù)推廣到種類(lèi)繁多的其他生物分子并獲得高分辨率的三維結構呢？Joachim Frank教授也在思考這個(gè)問(wèn)題，他在1975到1986年間發(fā)展了一種圖像處理方法，通過(guò)算法可以對電鏡下模糊的二維圖像進(jìn)行分析和合并，從而獲得相對清晰的三維結構。Frank教授提出的單顆粒三維重構算法對于實(shí)現無(wú)需結晶的蛋白質(zhì)三維結構解析至關(guān)重要，也是冷凍電鏡技術(shù)發(fā)展的基石。
Joachim Frank的圖像分析方法
Henderson教授1975年獲得細菌視紫紅質(zhì)三維結構時(shí)，用的是葡萄糖溶液來(lái)保護他的膜蛋白不會(huì )發(fā)生脫水。這一招對于很多水溶性蛋白來(lái)說(shuō)派不上用場(chǎng)。而將樣品直接冰凍，冰晶體會(huì )干擾電子束使得最后得到的圖像一團糟。有沒(méi)有辦法既能讓分子處于水環(huán)境又不形成冰晶體呢？Jacques Dubochet教授在1982年找到了一個(gè)完美的解決方案——讓水“玻璃化”。通過(guò)快速降溫，在生物分子周?chē)乃砸簯B(tài)形式被固化，形成無(wú)定形的冰。這樣一來(lái)，生物分子即使在真空中也能維持天然形態(tài)，而且玻璃態(tài)冰在電鏡下幾乎透明，不會(huì )形成干擾。這一突破使得快速制備高質(zhì)量冷凍電鏡樣品成為可能，冷凍電鏡技術(shù)也開(kāi)始推廣開(kāi)來(lái)。
Jacques Dubochet的玻璃化方法
在這些奠基者的工作之后，冷凍電鏡技術(shù)不斷地得到優(yōu)化，最近兩三年里發(fā)生了很重要的技術(shù)突破，包括直接電子探測器（Direct Electron Detectors）的發(fā)明和高分辨率圖像處理算法的改進(jìn)，使得冷凍電鏡的分辨率終于達到了夢(mèng)寐以求的原子級。以谷氨酸脫氫酶為例（下圖），通過(guò)冷凍電鏡能拿到的最高分辨率已經(jīng)達到1.8 ?。
冷凍電鏡解析的谷氨酸脫氫酶結構分辨率逐漸提高（從左到右）
冷凍電鏡技術(shù)的優(yōu)勢可總結為：
不需要結晶，很多難以結晶的大分子復合物也能成為研究對象，范圍大大擴展；
樣品量小制備快，可重復性高；
可解析天然、動(dòng)態(tài)的結構，非常適合生物分子。
冷凍電鏡技術(shù)的突破給結構生物學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)了一場(chǎng)大風(fēng)暴，大量高分辨率的分子機器、膜蛋白、蛋白質(zhì)復合物結構被報道，相關(guān)領(lǐng)域的研究也邁進(jìn)了一個(gè)嶄新的時(shí)代。
PS：冷凍電鏡的意義毋庸置疑，但三位“生物物理學(xué)家”分享2017年諾貝爾“化學(xué)”獎，這讓身為化學(xué)汪的筆者只能長(cháng)嘆一聲，唉……
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