1、質(zhì)粒骨架的選擇
CRISPR/Cas9質(zhì)粒按編輯細胞類(lèi)型可分為八種，Mammalian 、Bacteria 、Drosophila 、Plant、C. elegans 、Yeast 、Zebrafish 、Xenopus，根據質(zhì)粒所攜帶的編輯基因的不同，可分為野生型的cas9、突變型的cas9、cpf1、C2c2（可剪切RNA）。當然，還有一些篩選標記，如puro、GFP、RFP、mcherry、潮霉素等等，我們可以根據自己的需求選擇自己合適的質(zhì)粒。這里故意還掉了一種，最具有爭議的Ngago，本樓主也重復過(guò)這個(gè)試驗，也和大多數重復的人一樣，GFP驗證試驗時(shí)，看到熒光顯著(zhù)減弱（本人還特意構建了一種Ngago載體，效果比韓老師的效果好很多），但是當時(shí)沒(méi)有驗證這個(gè)減弱是切割還是敲低，非常遺憾自己想法太簡(jiǎn)單，以先入為主認為是切割而沒(méi)有去驗證；最終結果是劉東老師使用Ngago發(fā)現了有表型（斑馬魚(yú)的眼睛上有缺陷），這個(gè)就是很強的提示，需要去做下一步，盡管基因組上沒(méi)有被切割，有表型，那勢必會(huì )去看該基因表達的數據，最后才有這篇文章。劉東老師運氣也很好，knock down 有表型，如果沒(méi)表型，估計也會(huì )放棄。這里就說(shuō)到這，有不懂的可以留言詢(xún)問(wèn)。。具體分類(lèi)在addgene上有，網(wǎng)址http://www.addgene.org/crispr/。
2、酶切位點(diǎn)的選擇
插入sgRNA的酶切位點(diǎn)，質(zhì)?；緸檫@兩種，BsmbI和Bbsi，具體可以參見(jiàn)該質(zhì)粒的protocol，后續的連接、轉化、驗證protocol里面有，我就不啰嗦了。哦還忘了一件事，使用snapgene這個(gè)軟件可以很好地看質(zhì)粒圖譜，非常方便，強烈推薦??！
以慢病毒載體V2為例具體說(shuō)明
3、同源臂的設計
同源臂我們一般都是在切割位點(diǎn)的兩端各選一段，長(cháng)度大約1kb-2kb，效率還可以。當然了，有人也用40-100bp做了也做成功了，但基本原則是越長(cháng)效率越高。1kb-2kb效率已經(jīng)很高，所以這個(gè)最合適。有相關(guān)文獻支持，自己Pubmed查看。
4、啟動(dòng)子、目的基因及其終止子的擴增
這里也沒(méi)什么可說(shuō)的，啟動(dòng)子在我們選擇質(zhì)粒的時(shí)候就決定了，當然我們還可以改造以提高sgRNA的表達效率，這個(gè)時(shí)候我們可以通過(guò)方法篩選出該物種的啟動(dòng)子，替換上去就ok了。
目的基因的話(huà)，如果我們要做敲除，基本就是根據基因組，在外顯子區域設計sgRNA序列，切割后以非同源性末端接合（Non-homologous end joining, NHEJ），造成變異而使該基因失去功能。當然還有一種修復方式，同源性重組（Homologous recombination，HR）同源性重組修復是利用細胞內的染色體兩兩對應的特性，若其中一條染色體上的DNA發(fā)生雙股斷裂，則另一條染色體上對應的DNA序列即可當作修復的模版來(lái)回復斷裂前的序列，因此在某些條件下，同源性重組又稱(chēng)作基因轉換（gene conversion）。該方法是用于敲入基因，這個(gè)同時(shí)，我們可以加入抑制NHEJ修復的酶，同時(shí)就會(huì )促進(jìn)HR修復，提高重組插入效率。
終止子的話(huà)，沒(méi)什么特別，基本可以通用，SV40終止子、BGH終止子等。
5、donor載體的連接及克隆測序
donor載體的連接及克隆測序這個(gè)就是我們分子生物學(xué)學(xué)生的基本功了，就不敘述了。
6、細胞轉染及載體功能的驗證
細胞轉染的話(huà)，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)就好了，轉染試劑有lipo2000（適合siRNA和DNA共轉染）、lipo3000（適合DNA）、以及羅氏、qiagen的等。當然還有國產(chǎn)的一些轉染試劑，實(shí)驗室窮點(diǎn)就可以買(mǎi)下，效果還可以，漢恒生物的，比較便宜。
