KI細胞系的構建流程是先設計sgRNA及Donor模版，然后通過(guò)核糖核蛋白法（Ribonucleoprotein, RNP）或質(zhì)粒法等方法將sgRNA、Cas9蛋白和Donor模板轉進(jìn)細胞中。以RNP法為例，將合成的sgRNA、純化后的Cas9蛋白和Donor模板電轉進(jìn)目標細胞中，通過(guò)抗性篩選、PCR鑒定及測序確定KI細胞系是否構建成功。在這個(gè)過(guò)程中，sgRNA的設計、Donor模板的設計等均會(huì )影響最終的編輯結果，下面我們總結了會(huì )影響基因編輯效率的部分原因：
1. sgRNA的設計
sgRNA-Cas9在KI基因編輯系統中如“剪刀”一般精準切開(kāi)雙鏈DNA，這把“剪刀”鋒利與否和精確度能直接影響KI基因編輯系統的編輯效率。而sgRNA的設計就是重要的一步，它能影響目的片段能否精準插入和切割效率。因此需要綜合多方面因素來(lái)科學(xué)設計sgRNA。在設計時(shí)要綜合考慮候選編輯位點(diǎn)的序列、位置、正負鏈、GC含量、潛在的脫靶位點(diǎn)等信息?？梢詤⒄找韵略瓌t設計sgRNA：
（1） 候選編輯位點(diǎn)的正鏈靶點(diǎn)和負鏈靶點(diǎn)的切割效率相同，都可以設計靶點(diǎn)；
（2） 靶點(diǎn)的GC含量盡量不要低于40%，靶點(diǎn)序列GC含量偏高（50-70%）有較高的打靶效率；
（3） 靶點(diǎn)內不要有連續4個(gè)以上的T堿基，以防成為RNA Pol III的轉錄終止信號；
（4） 為了避免或減少非特異脫靶突變，應進(jìn)行靶點(diǎn)特異性分析。推薦使用CCTop（https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/）在線(xiàn)網(wǎng)頁(yè)進(jìn)行預測。最后挑選切割效率高、特異性好的一條或多條sgRNA開(kāi)展實(shí)驗。
2. RNP法和質(zhì)粒法的選擇
細胞內存在Cas9蛋白和sgRNA是實(shí)現基因敲入的重要一步。表達Cas9蛋白和sgRNA的常用方法有核糖核蛋白法（ ribonucleoprotein, RNP ）和質(zhì)粒法等。
3. Donor模板的設計
Donor模板對同源重組的效率具有重要的影響。在實(shí)驗過(guò)程中需要考慮以下因素：
（1）插入位點(diǎn)與雙鏈DNA缺口（Double Strand Breaks，DSB）的距離。距離不應該超過(guò)100 bp，而最理想的距離是在10 bp以?xún)?。如果超過(guò)這個(gè)距離，重組效率會(huì )大大降低。
（2）敲入片段的長(cháng)度。短片段的敲入（如Tag標簽等）可以使用ssODN。長(cháng)片段的敲入則需要dsDNA質(zhì)粒作為修復模板，需要注意的是敲入的片段不能過(guò)長(cháng)，一般不超過(guò)5 kb（包含抗性和熒光篩選），過(guò)長(cháng)會(huì )降低重組效率。
（3）同源臂的長(cháng)度。一般而言，加長(cháng)同源臂能一定程度上提高重組效率。并且插入的片段越大，所需要的同源臂長(cháng)度越長(cháng)，而同源臂一般選取約1500 bp較為合適。
（4）同源臂模板的選擇。同源臂建議以待突變的目的細胞基因組為模板擴增，避免不同細胞基因組差異導致同源臂不同源，降低重組效率。
4. 細胞類(lèi)型與生長(cháng)狀態(tài)
在瞬轉之前應注意細胞類(lèi)型是否合適，如關(guān)注細胞的增殖速度，增殖太慢的細胞發(fā)生重組效率也低下。還要保證細胞處于良好的生長(cháng)狀態(tài)、處于對數生長(cháng)期、合適的生長(cháng)密度、無(wú)支原體污染等。
5. 瞬轉電壓
合適的瞬轉電壓能影響編輯效率和細胞的存活，電壓過(guò)低會(huì )影響編輯效率，電壓過(guò)高會(huì )使細胞死亡。因而需要摸索不同細胞類(lèi)型的合適瞬轉電壓。一般而言，轉瞬電壓和細胞的直徑有關(guān)系，直徑越大電壓越低。建議結合預實(shí)驗，選擇最佳的瞬轉電壓。
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