連接酶及所用的緩沖液
a、所用的連接酶活性不好；
b、連接酶需要ATP的存在，而ATP在常溫或高溫條件下容易分解破壞，所有Buffer應該盡量新鮮。如果您的緩沖液時(shí)間太長(cháng)，建議您可以換一支新的Buffer試一下。
2、感受態(tài)細胞
感受態(tài)細胞反復凍融或者時(shí)間太長(cháng)，轉化效率降低?？梢灾匦轮谱饕慌惺軕B(tài)細胞。
3、DNA。
a、酶切。這一步還是很重要的。有的內切酶純度不高，其中有一些核酸內、外切酶的污染，這樣就會(huì )在酶切過(guò)程中在切割產(chǎn)生的末端上又切掉幾個(gè)堿基，而如果有這種情況，電泳又根本檢測不出來(lái)，所以再進(jìn)行連接時(shí)，就始終連接不上。
b、純化。應保證純化的DNA的質(zhì)量，如不含鹽、EDTA等的污染。因為連接酶連接時(shí)需要Mg離子，如果混有EDTA的話(huà)，就會(huì )抑制反應。
c、用量。連接時(shí)DNA的用量不要太高，建議體系中總的DNA濃度為1-10ug/ml。
4、連接反應體系
不建議用太大的體系，一般10-20ul即可
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