自誕生之初，CRISPR基因編輯技術(shù)一直無(wú)法克服的難題就脫靶效應。脫靶效應有可能導致基因突變，其不確定性和未知的安全風(fēng)險限制了基因編輯技術(shù)的推廣應用。目前的基因編輯技術(shù)尚無(wú)法精準靶向目標序列，并不產(chǎn)生脫靶效應?？茖W(xué)家認為，既然無(wú)法完全避免，為安全起見(jiàn)，更好地了解、控制可能產(chǎn)生的脫靶效應是一個(gè)不錯的選擇。因此，脫靶檢測方法的開(kāi)發(fā)成為了基因編輯領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。
近日，國際頂級學(xué)術(shù)期刊《科學(xué)》報道了一種新型基因編輯脫靶檢測方法，名為DISCOVER-Seq （Discovery of in situ Cas off-targets and verification by sequencing）。該方法可利用細胞和生物中DNA修復因子的募集特征，準確鑒定體內基因編輯細胞的脫靶位點(diǎn)和Cas活性的分子表征。該研究由加利福尼亞大學(xué)伯克利分校創(chuàng )新基因組研究所(IGI)、格拉德斯通研究所(Gladstone Institute)和阿斯利康(AstraZeneca)的研究團隊共同完成，文章題為“Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq”。
雖然已經(jīng)有不同的方法檢測CRISPR脫靶效應，但這些方法在實(shí)際應用中存在各種限制。例如，目前的脫靶檢測方法多使用純化的DNA或特定的細胞模型，無(wú)法實(shí)現體內直接檢測，并且存在產(chǎn)生假陽(yáng)性結果以及殺死被檢測的細胞等問(wèn)題。此外，最常用的檢測方法仍?xún)H限于實(shí)驗室培養的細胞，不適用于患者來(lái)源的干細胞或者動(dòng)物組織。
新開(kāi)發(fā)的DISCOVER-Seq方法，可通過(guò)精確追蹤體內DNA修復因子的募集，以單堿基分辨率揭示細胞中CaS活性的分子特性。經(jīng)研究驗證，DISCOVER-Seq適用于多種gRNA格式和Cas酶類(lèi)型，并可用于表征新的編輯工具。此外，經(jīng)研究驗證，該方法可在患者誘導多能干細胞和小鼠細胞等任何生物系統的基因編輯過(guò)程中實(shí)時(shí)檢測脫靶效應，而不僅限于實(shí)驗室培養的細胞，為基因編輯治療期間患者體內脫靶檢測鋪平了道路。
圖1. DISCOVER-Seq工作流程
文章第一作者、IGI博士后研究員Beeke Wienert表示：“在CRISPR切割時(shí)會(huì )破壞DNA。為了生存，細胞會(huì )將許多不同的DNA修復因子募集到基因組中的特定位點(diǎn)，修復斷裂并將切割末端連接在一起。如果我們能夠找到這些DNA修復因子的位置，也就可以識別被CRISPR切割的位點(diǎn)?！?/span>
由于DNA修復蛋白可以利用ChIP-Seq鑒定化膿性鏈球菌Cas9靶點(diǎn)，所以該研究對不同的DNA修復蛋白進(jìn)行了分析，并重點(diǎn)研究了MRN復合物的MRE11亞基。MRE11是第一個(gè)被募集到切割位點(diǎn)的修復蛋白，會(huì )緊密分布在Cas9切割位點(diǎn)周?chē)?/span>研究發(fā)現，在基因插入和缺失出現之前，MRE11與損傷DNA的結合就會(huì )達到高峰，并且在已知gRNA脫靶時(shí)很容易被檢測到。
研究人員表示：“人類(lèi)基因組非常龐大，如果打印完整的DNA序列，會(huì )得到一本16層樓高的小說(shuō)。當我們用CRISPR切割DNA時(shí)，就像刪除該小說(shuō)中特定頁(yè)面上的某個(gè)特定單詞一樣。DNA修復因子就像在書(shū)中添加不同類(lèi)型的書(shū)簽，有的標簽是針對整個(gè)章節，但MRE11可以確切到某一個(gè)字母?！?/span>
圖2. DISCOVER-Seq可在患者衍生的誘導多能干細胞和小鼠體內進(jìn)行實(shí)時(shí)的脫靶檢測。
在基因組檢測中，DISCOVER-Seq可以利用MRE11鑒定CRISPR切割的確切位點(diǎn)，檢測結果更可靠。大多數MRE11 ChIP-Seq的檢測結果與預測的Cas9切割位點(diǎn)一致，進(jìn)而能夠以單堿基分辨率鑒定核酸酶位點(diǎn)，揭示Cas活性的分子特征。需要注意的是，DISCOVER-Seq檢測方法依賴(lài)于細胞的自然修復過(guò)程，侵入性更小，且適用于多種gRNA形式和Cas酶類(lèi)型。
通過(guò)應用于新的細胞類(lèi)型和系統，DISCOVER-Seq還能揭示CRISPR基因組編輯機制的新見(jiàn)解，有助于人們更好地理解CRISPR的工作原理。DISCOVER-Seq大大簡(jiǎn)化了脫靶的檢測過(guò)程，同時(shí)提高了檢測結果的準確性。同時(shí)，該方法有助于我們更好地預測基因組編輯在臨床環(huán)境中的運作方式，改善臨床前研究，使基于CRISPR的療法更能滿(mǎn)足有需求的患者。
在基因編輯脫靶檢測方面，我國科學(xué)家也在不斷努力。今年3月，中國科學(xué)院等單位的研究人員成功開(kāi)發(fā)了一種新型脫靶檢測技術(shù)GOTI，該技術(shù)可在不借助于任何脫靶位點(diǎn)預測技術(shù)的情況下發(fā)現隨機脫靶位點(diǎn)，顯著(zhù)提高了基因編輯脫靶檢測的敏感性。點(diǎn)擊鏈接，查看此前報道
在治愈人類(lèi)罕見(jiàn)病、遺傳病方面，基因編輯技術(shù)被寄予厚望，但在過(guò)去的幾十年中，科學(xué)家始終難以克服脫靶效應這個(gè)難題，這也成為制約該技術(shù)成功應用于臨床的一大瓶頸。在更安全有效的基因編輯工具出現之前，精準的脫靶檢測技術(shù)或將成為基因編輯技術(shù)臨床轉化的關(guān)鍵。
參考資料：
1. Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq
https://science.sciencemag.org/content/364/6437/286.full?_ga=2.217470229.2076339049.1556000128-1911026261.1556000128
2. DISCOVER-Seq Detects Off-Target CRISPR Effects
https://www.genengnews.com/news/discover-seq-detects-off-target-crispr-effects/
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