| 回復人：rqs1,★★ (化工，痛并快樂(lè )著(zhù)！) 時(shí)間：2008-12-14 11:30:18 編輯 | 1樓 |
| 簡(jiǎn)單的說(shuō)，就是峰尾需要很長(cháng)時(shí)間才好回到基線(xiàn)！導致峰左右嚴重不對稱(chēng)！ | |
| 回復人：tangyyer,★★★★★ (有空來(lái)逛逛my blog: http://tangyyer.blog.hexun.com) 時(shí)間：2008-12-14 15:35:42 編輯 | 2樓 |
| 技術(shù)報告 改善反相HPLC中的峰拖尾 在反相HPLC中峰拖尾是一個(gè)普遍的現象。特別是分離堿性化合物和通過(guò)HPLC分析藥物成分時(shí)是經(jīng)常產(chǎn)生拖尾緣由。峰拖尾可以引起分離度降低，靈敏度減弱，精密度和定量變差。圖1表明峰之間的分離度和靈敏度與峰拖尾成負相關(guān)。圖2表明準確度和精密度因數據系統無(wú)法準確識別峰的起點(diǎn)和終點(diǎn)而受到影響。 圖1 拖尾對分離度和靈敏度的影響 當峰拖尾（T，拖尾因子）從1.0增加到2.0時(shí)，分離度（Rs）從1.5降到1.0。靈敏度（峰高）由于峰的體積增大和樣品的濃度降低而降低。 圖2 峰拖尾對準確度和精密度的不利影響 拖尾峰使數據系統難以準確確定峰的終點(diǎn)，故而影響準確度和精密度。在這個(gè)例子中，在B點(diǎn)測得到峰面積比在A(yíng)點(diǎn)測得的峰面積少約3%。 峰拖尾的原因，峰拖尾的主要原因有： 溶解樣品的溶劑比流動(dòng)像更強， 樣品量過(guò)載， 固定相中的硅醇基與胺類(lèi)物質(zhì)相結合反應， 硅膠吸附酸性化合物， 色譜柱柱床中有空隙。 只要確定了拖尾的原因就可以采取措施減少拖尾并消除之。（表1） 表1 峰拖尾：原因及解決方案 原因 解決方案 樣品溶劑極性強于流動(dòng)相 在流動(dòng)相中溶解樣品，盡可能降低樣品溶劑的強度 樣品量過(guò)載 減少進(jìn)樣量，參考表2中推薦的不同柱型對應的不同進(jìn)樣體積 硅醇基與胺類(lèi)物質(zhì)的結合 1.調節流動(dòng)相的pH<3.0。 2.增加流動(dòng)相的離子強度，25mM～50mM。 3.流動(dòng)相中增加競爭性的胺類(lèi)，10mM的TEA（三乙胺）。 4.選擇低硅醇活性的固定相。參照圖6 C18柱按固定相硅醇活性分級。 5. 酸性物質(zhì)在硅膠上的吸附 增加流動(dòng)相中鹽的濃度，25mM～50mM。 調節流動(dòng)相的pH<3.0 增加競爭性的有機酸，1%醋酸或者是0.1%TFA（三氟乙酸） 柱子空隙 更換新的色譜柱 嘗試填充空隙很少能達到較好的效果。 一、由于溶解樣品的溶劑極性強于流動(dòng)相而引起的拖尾 如果溶解樣品的溶劑極性強于流動(dòng)相，就會(huì )引起寬的甚至是拖尾的峰。有幾種線(xiàn)索可以幫助確定是由于此種原因引起的拖尾。第一種就是先流出的峰的拖尾較后流出的峰拖尾嚴重；另一種跡象就是進(jìn)樣量減少或者是樣品經(jīng)流動(dòng)相稀釋后進(jìn)樣峰拖尾減輕了。 如果懷疑拖尾的原因是流動(dòng)相的強度引起的，解決很簡(jiǎn)單。將樣品溶解在流動(dòng)相中，或者將樣品經(jīng)流動(dòng)相稀釋至進(jìn)樣后峰拖尾符合要求。 二、由樣品量過(guò)載引起的峰拖尾 當進(jìn)樣量超過(guò)柱子的容量，樣品峰會(huì )呈現一個(gè)直角三角形。當更多的樣品量注入時(shí)，峰的前端變得很尖而后端就拖尾更嚴重。另一個(gè)現象就是色譜柱過(guò)載后保留時(shí)間會(huì )隨樣品量的增加而提前。（見(jiàn)圖3）由樣品過(guò)載引起的峰拖尾的解決方案就是減少進(jìn)樣量。表2提供了各色譜柱的直徑及參考的最大進(jìn)樣量，表2還提供了進(jìn)樣量的范圍，因為實(shí)際進(jìn)樣量依賴(lài)于柱子的填料（具有高的表面積的填充材料可以具有大的進(jìn)樣量），分析物質(zhì)（分子量大的進(jìn)樣量要少），和其他的因素比如樣品在流動(dòng)相中的溶解性。 圖3 樣品量過(guò)載引起的拖尾 樣品過(guò)載，峰的前端會(huì )變得尖銳，后端拖尾，保留時(shí)間會(huì )稍微提前。如果峰形看上去有點(diǎn)像直角三角形，那么可能就是過(guò)載了。 表2 HPLC色譜柱的參考最大進(jìn)樣量 柱直徑（mm）ID 參考最大樣品量（mg） 10 35-65 4.6 4.5-9.0 3.0 2.0-4.0 表3 反相HPLC常用緩沖液 緩沖液 pKa 緩沖液范圍 UV截止波長(cháng)（nm） 磷酸鹽 2.1 1.1～3.1 200 7.2 6.2～8.2 12.3 11.3～13.3 醋酸鹽 4.8 3.8～5.8 210 檸檬酸鹽 3.1 2.1～4.1 230 4.7 3.7～5.7 5.4 4.4～6.4 Tris（三羥甲基氨基甲烷） 8.3 7.3～9.3 205 三乙胺 11.0 10.0～12.0 200 三、由固定相中的硅醇基與胺類(lèi)相互作用引起的拖尾 在反相HPLC中出現拖尾的另一個(gè)常見(jiàn)的原因是由于帶正電荷的溶液（胺類(lèi)）與固定相顆粒表面上的酸性硅醇發(fā)生了離子交換而引起的二次保留(圖 4)，具有顯著(zhù)的硅醇活性的固定相的色譜柱大部分都會(huì )發(fā)生此現象，而且中性pH（6～8）條件下比在酸性pH（<3）更易發(fā)生。 酸性和中性的化合物一般不受影響，一些堿性化合物更易受到此效應的影響。如果是因為硅醇的原因引起的拖尾，可以從下面幾部來(lái)糾正拖尾的問(wèn)題。首先，確認流動(dòng)相中有合適的緩沖鹽，可能的話(huà)盡量在pH<3的條件下操作。使用足夠的緩沖液控制pH并減少離子交換效應。 在pH<3的條件下操作，可使硅膠固定相上的硅醇基質(zhì)子化，減少了溶質(zhì)與硅醇反應的幾率。 圖4相互作用引起的峰拖尾 固定相表面的酸性硅醇基可以形成與堿性化合物反應的離子交換位點(diǎn)，經(jīng)反相HPLC分離胺類(lèi)化合物時(shí)，這種離子交換反應常常引起峰的保留（二次保留）和峰拖尾。 另一種解決拖尾的方法是在流動(dòng)相中加入競爭性的胺類(lèi)，加到流動(dòng)相中的三乙胺（TEA）就是這個(gè)目的。TEA可以與硅醇發(fā)生強的反應，并抑制樣品中的胺類(lèi)與硅醇反應。圖5是TEA如何提高峰形的例子，多數情況下，大約10mM的TEA足夠了。 有些色譜分析者反對向流動(dòng)相中加入競爭性的胺類(lèi)，因為增加了分析方法的復雜性并且用一種不易逆轉的方法改變了色譜柱的性質(zhì)。強度胺類(lèi)，像三乙胺，不易從色譜柱上洗脫下來(lái)。那意味著(zhù)用過(guò)含有TEA的色譜柱就不再適合應用于流動(dòng)相中不含TEA的分析。 圖5 向流動(dòng)相中加入TEA用來(lái)提高峰形 色譜柱：Eclipse XDB-C8 4.6*150mm 流動(dòng)相：85%25mMNa2HPO4，pH7.0，15%ACN 流速：1.0ml/min 溫度：35℃ 樣品：苯丙胺類(lèi) 苯丙醇胺 麻黃堿 苯丙胺 甲基苯丙胺 苯三胺 向流動(dòng)相中加入競爭性的胺類(lèi)，三乙胺等，可以減少峰拖尾。三乙胺與硅醇強烈作用，減少了樣品混合物中胺類(lèi)與硅醇的作用。阿米替林常用來(lái)檢測反相HPLC色譜柱的硅醇活性。下表根據阿米替林的對稱(chēng)性（峰拖尾）對色譜柱進(jìn)行了分類(lèi)。其中阿米替林具有較低的對稱(chēng)性的柱子具有較低的硅醇活性，這些色譜柱是常常用來(lái)用反相HPLC分離胺類(lèi)物質(zhì)的最好選擇。數據來(lái)源于國家標準化研究所對標準參考物質(zhì)的分析認證870“液相色譜用柱性能測試混合物” 使用三乙胺可以不用選擇低硅醇活性的固定相。圖6根據硅醇的活性分列出了常用的C18反相色譜柱，在圖6中的分類(lèi)根據測定阿米替林的對稱(chēng)性，一種胺類(lèi)常用來(lái)測定固定相的硅醇活性。阿米替林在固定相中具有較低拖尾（低對稱(chēng)值）時(shí)，該固定相就顯示較低的硅醇活性并且檢測堿性化合物時(shí)就會(huì )有較低的拖尾。 圖6 根據硅醇活性排列的常用C18柱 色譜柱：4.6×150mm，5um 流動(dòng)相：80%甲醇20%0.05M磷酸鹽緩沖液pH7 流速：2.0ml/min 溫度：24℃ 樣品：阿米替林 四、酸性化合物在硅膠上吸附引起的拖尾 雖然較胺類(lèi)引起的拖尾少，酸類(lèi)物質(zhì)有時(shí)候引起峰的展寬和拖尾主要由于硅膠固定相的吸附。糾正因為此類(lèi)原因引起的拖尾就應提高流動(dòng)相中鹽的濃度來(lái)抑制二次反應，降低流動(dòng)相的pH使硅醇和溶質(zhì)質(zhì)子化，必要時(shí)可以向流動(dòng)相中加入競爭性的酸（圖7）。 圖7 酸性化合物引起的峰拖尾通?？梢韵蛄鲃?dòng)相中加入酸來(lái)改善 色譜柱：4.6×150mm，C18 流動(dòng)相：40%5mMNaH2PO460ACN 樣品：布洛芬 布洛芬，酸性化合物，嚴重拖尾，向流動(dòng)相中加入乙酸可以改善。乙酸優(yōu)先和硅膠固定相表面的酸性硅醇基反應，抑制了布洛芬和硅醇基的反應，減低了拖尾。 五、由于柱床空隙引起的拖尾 色譜柱床的柱頭空隙可引起峰的展寬有時(shí)候會(huì )拖尾。雖然幾年前柱子有空隙非常普遍，生產(chǎn)商現在完善了填裝技術(shù)生產(chǎn)更高質(zhì)量的色譜柱，除非在極高的壓力或流速的條件下裝柱，很少色譜柱中有空隙，然而，如果通常色譜柱具有良好的柱效，突然發(fā)現所有的峰均拖尾時(shí)，可能是柱子有空隙。先洗脫出的峰較后洗脫的峰更易受柱空隙的影響。 雖然許多色譜分析者嘗試用相同的固定相材料修補柱子的空隙，就經(jīng)驗來(lái)講，此法很少能達到預期的效果。由于柱子空隙引起的拖尾最好的解決方法就是換掉它，這樣可以節省時(shí)間，金錢(qián)，減少麻煩。 | |
| 回復人：tangyyer,★★★★★ (有空來(lái)逛逛my blog: http://tangyyer.blog.hexun.com) 時(shí)間：2008-12-14 15:37:29 編輯 | 3樓 |
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