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柱層析技術(shù)也稱(chēng)柱色譜技術(shù)。一根柱子里先填充不溶性基質(zhì)形成固定相，將混合樣品加到柱子上后用特別的溶劑洗脫，溶劑組成流動(dòng)相。在樣品從柱子上洗脫下來(lái)的過(guò)程中，根據混合物中各組分在固定向和流動(dòng)相中的分配系數不同經(jīng)過(guò)多次反復分配，將不同組分逐一分離。
根據填充基質(zhì)和樣品分配交換原理不同，離子交換層析，凝膠過(guò)濾層析和親和層析是三種分離混合物的經(jīng)典層析技術(shù)。
柱層析分離凈化的實(shí)驗技巧和方法
1 柱層析操作方法的選擇
目前 ,柱色譜分離的操作方式 ,主要包括常壓分離、減壓分離和加壓分離 3種模式。常壓分離是最簡(jiǎn)單的分離模式方便、簡(jiǎn)單 ,但是洗脫時(shí)間長(cháng)。減壓分離盡管能節省填料的使用量 ,但是由于大量的空氣通過(guò)填料會(huì )使溶劑揮發(fā) ,并且有時(shí)在柱子外面會(huì )有水汽凝結 ,以及有些易分解的化合物也難以得到 ,而且還必須同時(shí)使用水泵或真空泵抽氣。加壓分離可以加快淋洗劑的流動(dòng)速度 ,縮短樣品的洗脫時(shí)間 ,是一種比較好的方法 ,與常壓柱類(lèi)似 ,只不過(guò)外加壓力使淋洗液更快洗脫。壓力的提供可以是壓縮空氣 ,雙連球或者小氣泵等。
2 柱子規格的選擇
市場(chǎng)上有各種規格的柱層析分離柱。柱子長(cháng)了 ,相應的塔板數就高 ,分離就好。目前市場(chǎng)上的柱子 ,其徑高比一般在1: 5～10范圍 ,在實(shí)際使用時(shí) ,填料量一般是樣品量的 30～40倍 ,具體的選擇要根據樣品的性質(zhì)和含量進(jìn)行具體分析。如果所需組分和雜質(zhì)的分離度較大 ,就可以減少填料量 ,使用內徑相對較小的柱子 (如 2 cm × 20 cm的柱子 ) ;如果 Rf相差不到 0.1,就要加大柱子 ,增加填料量 ,比如用 3 cm內徑的柱子。
3 裝柱
柱層析色譜柱的填裝主要有濕法和干法兩種 ,濕法省事 ,一般用淋洗劑溶解樣品 ,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等 ,但溶劑越少越好 ,不然溶劑就成了淋洗劑了。柱子底端的活塞一定不要涂潤滑劑 ,否則會(huì )被淋洗劑帶到淋洗液中 ,可以采用聚四氟乙烯材料的閥門(mén)。干法和濕法裝柱沒(méi)什么實(shí)質(zhì)性差別,只要能把柱子裝實(shí)就行。裝完的柱子應該有適度的緊密(太密了淋洗劑流速太慢 ) ,并且一定要均勻 ,不然樣品就會(huì )從一側斜著(zhù)流動(dòng)。同時(shí)柱中不能有大氣泡 ,大多數情況下有些小氣泡沒(méi)太大的影響 ,因為只要加壓氣泡就可消失。但是柱子更忌諱的是開(kāi)裂 ,開(kāi)裂會(huì )影響分離效果 ,甚至報廢。
4 溶劑的選擇
選擇一個(gè)合適的溶劑系統是柱層析分離的關(guān)鍵。在選用柱層析洗脫劑時(shí)首先要考慮三個(gè)方面的因素:溶解性 ( Solubil2ity)、親合性 (Affinity)和分離度 (Res oluti on)。溶劑應選擇價(jià)廉、安全、環(huán)保的 ,可以考慮石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷價(jià)格較高 ,乙醚很易揮發(fā) ,二氯甲烷和甲醇與硅膠的吸附是一個(gè)放熱過(guò)程 ,易使柱子產(chǎn)生氣泡。其他的溶劑用的相對較少 ,要依不同需要選擇。另外值得一提的是 ,由于我們進(jìn)行的是痕量分析 ,淋洗劑的純度必須關(guān)注 ,一般使用農藥殘留級或 HPLC級的 ,如果是分析純的必須進(jìn)行精制。同時(shí)溶劑在過(guò)柱后最好回收使用 ,一方面環(huán)保 ,另一方面也能節省部分經(jīng)費。
5 上樣
用少量的溶劑溶解樣品加樣 ,加完后將底端的活塞打開(kāi) ,待溶劑層下降至石英砂面時(shí) ,再加少量的低極性溶劑 ,然后再打開(kāi)活塞 ,如此兩三次 ,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑 ,一開(kāi)始不要加壓 ,等溶解樣品的溶劑和樣品層有一段距離 (2～4 cm) ,再加壓 ,這樣避免了溶劑 (如二氯甲烷等 )夾帶樣品快速下行。很多樣品在上柱前粘性較大 ,上樣后在柱上又會(huì )析出 ,這一般都是比較大量的樣品才會(huì )出現 ,是因為填料對樣品的吸附飽和所致。有些樣品溶解性差,能溶解的溶劑 (比如 DMF,DMSO等)又不能上柱 ,這樣就必須用干法上柱了。
6 淋洗液的收集和濃縮
用硅膠作固定相過(guò)柱子的原理是一個(gè)吸附與解吸的平衡。如果樣品與硅膠的吸附比較強的話(huà) ,就不容易流出 ,這時(shí)可以采用氧化鋁作固定相。柱層析后的淋洗液 ,由于使用了較多的溶劑 ,必須進(jìn)行濃縮 ,如果待測物具有一定的揮發(fā)性 ,最好使用常壓揮發(fā)溶劑 ,否則易導致檢測結果偏低。
做有機合成的都知道柱層析的重要性，下面摘錄一些有關(guān)柱層析的技術(shù)要領(lǐng)。如覺(jué)得不錯，希望版主能打分啊。呵呵，我需要錢(qián)買(mǎi)書(shū)。
裝柱子（添硅膠）時(shí)，有兩種方法：即濕法裝柱和干法裝柱，二者各有優(yōu)劣。不論干法還是濕法，硅膠（固定相）的上表面一定要平整，并且硅膠（固定相）的高度一般為15cm左右，太短了可能分離效果不好，太長(cháng)了也會(huì )由于擴散或拖尾導致分離效果不好。
濕法裝柱是先把硅膠用適當的溶劑拌勻后，再填入柱子中，然后再加壓用淋洗劑'走柱子'，本法最大的優(yōu)點(diǎn)是一般柱子裝的比較結實(shí)，沒(méi)有氣泡。
干法裝柱則是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側，至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至合適高度，最后再用油泵直接抽，這樣就會(huì )使得柱子裝的很結實(shí)。接著(zhù)是用淋洗劑'走柱子'，一般淋洗劑是采用TLC分析得到的展開(kāi)劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。通常上面加壓，下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。干法裝柱較方便，但最大的缺陷在于'走柱子'時(shí)，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺(jué)到），容易產(chǎn)生氣泡，這一點(diǎn)在使用低沸點(diǎn)的淋洗劑時(shí)如乙醚，二氯甲烷更為明顯。雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易察覺(jué)，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時(shí)候，氣泡就會(huì )釋放出來(lái)，嚴重時(shí)，整個(gè)柱子變花，樣品不可能平整地通過(guò)，當然也就談不上分離了。解決的辦法是：第一、硅膠一定要天結實(shí)；第二、一定要用較多的溶劑'走柱子'，一定要到柱子的下端不再發(fā)燙，恢復到室溫后再撤去壓力。
也有介紹在硅膠的最上層填上一小層石英砂，防止添加溶劑的時(shí)候，使得樣品層不再整齊。但我的感覺(jué)是如果小心上樣，添加溶劑，則沒(méi)有這個(gè)必要。
上樣也有干法和濕法之分：干法就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。濕法上樣就是用少量溶劑（最好就是展開(kāi)劑，如果展開(kāi)劑的溶解度不好，則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，再用膠頭滴管轉移得到的溶液，沿著(zhù)層析柱內壁均勻加入。然后用少量薌洗滌后，再加入。濕法較方便，熟手一般采用此法關(guān)于TLC和柱層析之我的體會(huì )(轉)
柱層析和TLC是有機化學(xué)工作者必須下苦功夫的兩項實(shí)驗技術(shù)。這兩項技術(shù)掌握與否，對于提高實(shí)驗的效率至關(guān)重要。常見(jiàn)的例子是：在柱層析時(shí)，由于層析柱中的硅膠填料裝得不均勻（沒(méi)有填嚴實(shí)），使得柱子在淋洗過(guò)程中就因為出現太多氣泡變花，導致分離效果不好。更常見(jiàn)的例子是：層析柱雖然裝得不錯，但是由于淋洗劑選擇不恰當，結果導致幾十毫克產(chǎn)品，用了幾百毫升淋洗劑都還沒(méi)有完全分離。分離同樣的東西，熟手可能只需要半個(gè)小時(shí)，而一個(gè)層析技術(shù)不過(guò)關(guān)的人可能半天都不能得到純品。由此可見(jiàn)，這兩項技術(shù)掌握與否，對于提高工作效率，減輕工作量，減少有機溶劑的使用，從而對身心健康和環(huán)境保護都有明顯的作用。
柱層析關(guān)鍵在于柱子是否裝好和淋洗劑是否選擇恰當。而淋洗劑的選擇則是通過(guò)TLC確定。這里要指出的一點(diǎn)是：TLC的作用除了跟蹤反應進(jìn)程，檢測試劑和原料純度外，一個(gè)重要的用途就是為柱層析選擇適當的淋洗劑。
上樣完畢后，接著(zhù)即用淋洗劑淋洗。淋洗劑一般采用TLC分析得到的展開(kāi)劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。由于層析柱和薄板的不同，即使兩者使用的硅膠都相同，但是在把TLC分析得到的展開(kāi)劑用在柱層析時(shí)，也顯得極性偏大，所以要稀釋一倍，但又不能稀釋太多，否則成了靠擴散作用來(lái)分離，效果也不會(huì )好。
接下來(lái)談TLC，需要切記的是：
第一、某種樣品在這種展開(kāi)劑中只顯示一個(gè)點(diǎn)，并不等于在別的展開(kāi)劑中也只顯示一個(gè)點(diǎn)。因此在尋找展開(kāi)劑時(shí)，多嘗試幾種比例不同，成分不同的展開(kāi)劑。展開(kāi)劑的極性太小，點(diǎn)分不開(kāi)，極性太大，也分不開(kāi).一般以目標產(chǎn)物的Rf值在0.3左右為最佳。
第二、點(diǎn)不能點(diǎn)得太濃,否則容易重疊,不易判斷,因為如果兩個(gè)點(diǎn)相近的話(huà),一濃就變成一個(gè)點(diǎn)了。第三、板上點(diǎn)的展開(kāi)的清晰程度和溶劑的極性和物質(zhì)在該溶劑中的溶解性有關(guān)，只有兩者比較合適才能有一個(gè)交好的分離效果。
選擇適當的展開(kāi)劑是首要任務(wù).一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷<><><><><><><><甲醇使用單一溶劑，往往不能達到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個(gè)高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區分度的作用，常用的溶劑組合有：petroleumether thyl="" acetate,="" petroleum="" ether/acetone,="" petroleum="" ether/ether,="" petroleumether/ch2cl2,="" ch2cl2/ethyl="" acetate,="" ethyl="" acetate/="" meoh,="" chcl3/="" ethyl="">
展開(kāi)劑的比例要靠嘗試.一般根據文獻中報道的該類(lèi)化合物用什么樣的展開(kāi)劑，就首先嘗試使用該類(lèi)展開(kāi)劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個(gè)分離效果好的展開(kāi)劑。很多時(shí)候,展開(kāi)劑的選擇要靠自己不斷變換展開(kāi)劑的組成來(lái)達到最佳效果。我在實(shí)驗中，為了實(shí)現一個(gè)配體與其他雜質(zhì)有效分離，曾經(jīng)嘗試了所有的溶劑用來(lái)兩兩組合后，最后才找到petroleumether/THF這類(lèi)不常見(jiàn)的混合溶劑。
一般把兩種溶劑混合時(shí),采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開(kāi)的跡象,再調整比例,達到最佳效果，如果沒(méi)有分開(kāi)的跡象，最好是換溶劑。
對于在硅膠中這種酸性物質(zhì)上易分解的物質(zhì)，在展開(kāi)劑里在利用TLC跟蹤反應時(shí)，在點(diǎn)板的時(shí)候往往是反應體系的混和溶液點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)A，每種難揮發(fā)的原料各點(diǎn)一個(gè)點(diǎn)B,C, D等等，然后所有的原料和反應體系的混合溶劑再共同點(diǎn)一個(gè)混合點(diǎn)X，這些點(diǎn)在板上的位置如圖所示： A X B C D
這樣的好處是展開(kāi)后可以清楚地看見(jiàn)每個(gè)點(diǎn)的位置，把A這個(gè)點(diǎn)展開(kāi)后的各個(gè)層份的點(diǎn)與B,C,等原料比較，從而判斷原料消失沒(méi)有，點(diǎn)混合點(diǎn)X的目的在于，方便觀(guān)察，因為有時(shí)候，板展開(kāi)后，各點(diǎn)的位置有些變形，或者由于邊緣效應等等，使得判斷不易。
利用TLC判斷物質(zhì)的純度時(shí)，往往要和NMR相結合，因為某種樣品在這種展開(kāi)劑中只顯示一個(gè)點(diǎn)，并不等于在別的展開(kāi)劑中也只顯示一個(gè)點(diǎn)。但有趣的是，由于H NMR可鑒別的純度也就在95%左右，有時(shí)候H NMR現示較純的東西，一點(diǎn)板就會(huì )發(fā)現有幾個(gè)點(diǎn)。所以，兩者要結合使用。但是自己以前的樣品，則可以只通過(guò)點(diǎn)板來(lái)判斷純度。
硅膠柱層析原理
硅膠層析法的分離原理是根據物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，整個(gè)層析過(guò)程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸過(guò)程。
硅膠柱層析流動(dòng)相
極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統；極性較大的用甲醇：氯仿系統；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸
硅膠柱層析慣用方法
1.稱(chēng)量。200-300目硅膠，稱(chēng)30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱(chēng)40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。
2.攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分攪拌。如果洗脫劑是石油醚/乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說(shuō)明溶劑中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話(huà)，必須預先用無(wú)水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無(wú)水氯化鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對酸敏感，不能用氯仿體系過(guò)柱。
3.裝柱。將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入約1/3體積石油醚（氯仿），裝上蓄液球，打開(kāi)柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內。隨著(zhù)沉降，會(huì )有一些硅膠沾在蓄液球內，用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。
4.壓實(shí)。沉降完成后，加入更多的石油醚，用雙聯(lián)球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無(wú)論走常壓柱或加壓柱，都應進(jìn)行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過(guò)柱時(shí)由于柱床萎縮產(chǎn)生開(kāi)裂。
5.上樣。干法濕法都可以。海沙是沒(méi)必要的。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑，而不會(huì )沖壞硅膠表面。
6.過(guò)柱和收集。柱層析實(shí)際上是在擴散和分離之間的權衡。太低的洗脫強度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子：10mg上樣量，1g硅膠H，0.5ml收一餾分；1-2g上樣量，50g硅膠（200-300目），20-50ml收一餾分。
7.檢測。要更多地使用專(zhuān)用噴顯劑，如果僅用紫外燈，會(huì )損失較多產(chǎn)品，紫外的靈敏度一般比噴顯劑底1-2個(gè)數量級。
8.送譜。收集的產(chǎn)品旋干，在送譜前通常需要重結晶。如果樣品太少或為液體，可過(guò)一小凝膠柱，作為送譜前的最后純化手段?？沙渥V1.5ppm左右所謂的“硅膠”峰。
注意事項
1.先根據TLC方法篩選好洗脫劑，使兩相鄰物質(zhì)Rf值之差最大化
2.將柱子必須裝平整、均勻
3.考慮有限柱填料的吸附量
4.可考慮用梯度法分開(kāi)并洗脫
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