MDx 2020精彩預告
近年分子診斷在體外診斷細分板塊中以破軍之勢一路走高，加之2019年末疫情公衛事件的爆發(fā)，更是將核酸檢測/分子診斷帶向市場(chǎng)風(fēng)口與焦點(diǎn)所在。由此，已經(jīng)成功舉辦五屆的MDx2020第六屆中國先進(jìn)分子診斷技術(shù)與應用論壇將于8月6-7日在上海嶄新上線(xiàn)。論壇將深度探討分子診斷“病原檢測+腫瘤診斷”兩大潛力應用場(chǎng)景下，技術(shù)及產(chǎn)品的申報注冊與評價(jià)驗證、mNGS、PCR、液體活檢等技術(shù)在病原檢測中的開(kāi)發(fā)挑戰與應用、NGS下的大panel腫瘤檢測產(chǎn)品的注冊與評價(jià)、CRISPR檢測等革命性前沿技術(shù)的實(shí)踐突破對于行業(yè)的刺激與啟示等分子診斷行業(yè)年度熱門(mén)議題，與行業(yè)專(zhuān)家共探先鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)與產(chǎn)品申報落地之路！
共抗疫情
在中國疫情防控工作取得了明顯成效的時(shí)候，境外疫情暴發(fā)增長(cháng)態(tài)勢卻仍在持續，導致我國外防輸入壓力增大，國內防止疫情反彈的復雜性也在增加。為貫徹落實(shí)常態(tài)化疫情防控工作中“外防輸入、內防反彈”的工作要求，進(jìn)一步強化醫療機構感染防控的各項措施，最大限度降低院內感染，鞏固來(lái)之不易的防控成果，國務(wù)院于5月1日發(fā)布了《關(guān)于落實(shí)常態(tài)化疫情防控要求進(jìn)一步加強醫療機構感染防控工作的通知》，強調：
1.充分認識院內感染防控面臨的嚴峻形勢
2.嚴格落實(shí)發(fā)熱門(mén)診管理要求
3.加強患者收入院管理
4.強化新冠病毒核酸檢測
5.嚴格落實(shí)標準預防
6.開(kāi)展院內感染風(fēng)險排查整頓
其中關(guān)于核酸檢測能力方面強調“各地應當加強醫療機構實(shí)驗室建設，對所有三級醫院以及縣醫院開(kāi)展建設，使其迅速達到新冠病毒核酸檢測條件；對其他二級以上醫院也應當同時(shí)加強建設，使其逐步達到新冠病毒核酸檢測條件，根據疫情防控形勢需要隨時(shí)能夠開(kāi)展核酸檢測工作?！?/p>
一般三級醫院都擁有標準PCR實(shí)驗室與具備核酸檢測的能力。而此次對二級醫院也提出同樣要求，意味著(zhù)二級醫院也需要配備PCR實(shí)驗室。根據國家衛健委公布的最新數據，截止2019年2月底我國三級醫院2582所，二級醫院9061所，一級醫院10084所。由此可以預見(jiàn)全國各地將迎來(lái)PCR實(shí)驗室建設的熱潮。本文就PCR實(shí)驗室設計、裝修，相關(guān)儀器設備，人員配置及管理做了如下總結，供大家交流學(xué)習。
場(chǎng)地要求及實(shí)驗室設計
場(chǎng)地要求一般參照以下文件：
《醫療機構管理條例》
《醫療機構臨床實(shí)驗室管理辦法》
《臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室管理暫行辦法》
《醫療機構臨床基因擴增實(shí)驗室管理辦法》
標準的PCR實(shí)驗室一般分為四個(gè)區，一區為試劑準備區，二區為標本制備區，三區為PCR擴增區，四區為產(chǎn)物分析區。為避免交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區域必須嚴格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增反應混合物配制和擴增區→擴增產(chǎn)物分析區。各實(shí)驗區之間的試劑及樣品傳遞應通過(guò)傳遞窗進(jìn)行。場(chǎng)地一般要求在80平米以上，此標準PCR實(shí)驗室可開(kāi)展包括新冠病毒在內的常規分子檢測項目。而如今市面上絕大部分新冠病毒檢測試劑盒是在熒光定量PCR平臺上開(kāi)發(fā)的，因此沒(méi)有產(chǎn)物分析區也不會(huì )影響新冠病毒的檢測，60-80平米的場(chǎng)地就能滿(mǎn)足要求，但是其他如基于一代測序與基因芯片的檢測項目就無(wú)法開(kāi)展。大致設計如下圖：
PCR實(shí)驗室的場(chǎng)地限制條件較多，且因時(shí)間要求更為緊迫，部分醫院可能連50平米的場(chǎng)地都無(wú)法提供，為了能盡快滿(mǎn)足各醫院的新冠病毒檢測需求，一個(gè)非常緊湊的PCR實(shí)驗室可以將空間設計在僅為35平米左右，但是其防污染能力較差，小編不推薦。
不管是幾個(gè)區，可將PCR過(guò)程分成試劑準備、標本制備和PCR擴增檢測三個(gè)獨立組成。整個(gè)區域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨立實(shí)驗區設置有緩沖區，同時(shí)各區通過(guò)氣壓調節，使整個(gè)PCR實(shí)驗過(guò)程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
在三個(gè)實(shí)驗區和三個(gè)緩沖區頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準備區和標本制備區還設置移動(dòng)紫外線(xiàn)燈，對實(shí)驗桌進(jìn)行局部消毒。
試劑和標本通過(guò)機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過(guò)程中不受污染（人物分流）。
地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好，便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒(méi)有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚，瓷磚間接縫需要小于2mm。
PCR實(shí)驗室空調通風(fēng)系統設計及壓力控制
PCR實(shí)驗室并沒(méi)有嚴格的凈化要求，但是為避免各個(gè)實(shí)驗區域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時(shí)，要嚴格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗區的壓力要求。
1、試劑貯存和準備區
該實(shí)驗區主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區，不得經(jīng)過(guò)其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。
對與氣流壓力的控制，本區并沒(méi)有嚴格的要求。
2、標本制備區
該區域主要進(jìn)行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時(shí)cDNA的合成。
本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為正壓，以避免從鄰近區進(jìn)入本區的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì )發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區內不必要的走動(dòng)。
3、擴增反應混合物配制和擴增區
該區域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來(lái)自樣本制備區) 的加入和主反應混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區) 制備成反應混合液等也可在本區內進(jìn)行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開(kāi)反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區內進(jìn)行。
本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為負壓，以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區內的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應在超凈臺內進(jìn)行。
4、擴增產(chǎn)物分析區
該區域主要進(jìn)行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測，此區域可不設。
本區是最主要的擴增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此對本區的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區域為負壓，以避免擴增產(chǎn)物從本區擴散至其它區域。
PCR實(shí)驗室污染的預防與控制
PCR實(shí)驗室設計的核心問(wèn)題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見(jiàn)的有以下幾種污染類(lèi)型：擴增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實(shí)驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗結果必須作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗。所以發(fā)生污染后再?lài)@實(shí)驗室來(lái)尋找污染源不但耗時(shí)而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應是預防，而不是排除。
1、工作區域的嚴格劃分
（1）各個(gè)實(shí)驗區域設置合理；
（2）各個(gè)實(shí)驗區域要有明顯的標記（如醒目的門(mén)牌或不同的地面顏色等），以避免各個(gè)不同實(shí)驗區域設備物品、試劑等發(fā)生混淆。
2、合理的系統設置
（1）合理的空調通風(fēng)系統設置，盡量采用全送全排的空調系統；
（2）嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗區內不同的壓力要求。
3、規范的操作
（1）臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓，經(jīng)培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作；
（2）在實(shí)驗操作過(guò)程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施；
（3）清潔工作及時(shí)、正確。實(shí)驗工作結束后，必須立即對本區進(jìn)行清潔。除常規的消毒液體對表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線(xiàn)燈的照射消毒外，對一些實(shí)驗設備還應進(jìn)行高壓消毒處理。
4、嚴格的管理
（1）嚴格控制進(jìn)出實(shí)驗室的人員。與實(shí)驗無(wú)關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗室，有條件的情況下要設置獨立的通道和進(jìn)出整個(gè)實(shí)驗區的門(mén)；
（2）在各個(gè)實(shí)驗區域使用帶有明顯區別標志的工作服（如不同顏色），當工作人員離開(kāi)時(shí)不得將本區的工作服帶至其它區域；
（3）盡量減少在實(shí)驗區內不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性。
（4）擴增產(chǎn)物分析區是最主要的擴增產(chǎn)物污染來(lái)源，廢液不能在實(shí)驗室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠離實(shí)驗室的地方棄掉，用過(guò)的吸頭等一次性材料也應經(jīng)消毒液浸泡消毒后統一處理，如焚燒等；
（5）擴增產(chǎn)物分析區可能會(huì )用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應特別注意實(shí)驗人員的安全防護。
5、完備的實(shí)驗室配套設施
完備的實(shí)驗室配套設施是保證實(shí)驗工作的必要條件，應根據各個(gè)實(shí)驗室實(shí)驗內容的不同配備相應的設備和儀器，如超凈工作臺、離心機、加樣器等。
PCR實(shí)驗室主要設備見(jiàn)下表
本表所列儀器為滿(mǎn)足新冠病毒檢測所需的最低配置，空調排風(fēng)系統等不算在內。
PCR實(shí)驗室質(zhì)量控制
為實(shí)現高質(zhì)量的檢測結果，采取嚴格的實(shí)驗室管理體系極為重要
根據實(shí)驗室的具體情況制定和編寫(xiě)質(zhì)量體系文件，《質(zhì)量手冊》、《程序文件》、《作業(yè)指導書(shū)》，并嚴格執行。
管理體系的特點(diǎn)是應有明確的目的、規范的管理、有效的制約、高效并自我調節的機制，具體要求如下：
建立完善的SOP文件，對完成各項質(zhì)量活動(dòng)的方法作出規定，每個(gè)SOP都應對一個(gè)或一組相互關(guān)系的活動(dòng)進(jìn)行描述。
每個(gè)SOP文件應說(shuō)明該項質(zhì)量各環(huán)節的輸入、轉換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關(guān)活動(dòng)的接口關(guān)系。
明確每個(gè)環(huán)節轉換過(guò)程中各項因素的要求，即由誰(shuí)做、做什么、做到什么程序、達到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報告，以及相應的審批手續。
規定在質(zhì)量活動(dòng)中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施。SOP應簡(jiǎn)練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴格遵守。
盡量減少在實(shí)驗區內不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性。擴增產(chǎn)物分析區是最主要的擴增產(chǎn)物污染來(lái)源，廢液必須經(jīng)消毒液浸泡后在遠離實(shí)驗室的地方棄掉，用過(guò)的一次性材料也應經(jīng)消毒液浸泡后統一處理。
用到某些有毒物質(zhì)，應特別注意實(shí)驗人員的安全防護。完備的實(shí)驗室配套設施是保證實(shí)驗工作的必要條件。
人員配置
為保障實(shí)驗室的正常運行需要1名副高職稱(chēng)以上的檢驗技術(shù)人員，2名中級職稱(chēng)以上的檢驗技術(shù)人員，目前對新冠病毒檢測能力需求迫切，但是一個(gè)高質(zhì)量PCR實(shí)驗室的建設也不是在朝夕之間能完成。
文章資料整理自： 檢驗星空、盾恩醫學(xué)
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