作者：趙筱萍 何旭瑛 嚴杰
【關(guān)鍵詞】 腫瘤疫苗
【摘要】 樹(shù)突狀細胞（Dendritic Cell，DC）是體內最強的抗原遞呈細胞（APC），具有激活T細胞和誘導免疫反應的特殊功能。大量研究顯示，DC在抗腫瘤的免疫反應、腫瘤監視等過(guò)程 中均起到重要作用。DC免疫治療應用于臨床的問(wèn)題已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，并取得一定的進(jìn)展。本文就DC在基礎研究、抗腫瘤免疫治療應用及目前存在的問(wèn)題等方面 作一綜述。
【關(guān)鍵詞】 樹(shù)突狀細胞 抗原遞呈細胞 免疫治療 腫瘤疫苗
樹(shù)突狀細胞（Dendritic Cell，DC）是目前發(fā)現的功能最強的專(zhuān)職性抗原遞呈細胞（Antigen-presenting Cells，APC），能攝取和加工遞呈抗原，具有強大的激活CD8 + 、CTL及CD4 + T輔助細胞的能力，控制著(zhù)體內免疫反應的過(guò)程，在免疫應答中處于中心地位，因而成為腫瘤免疫反應的中心環(huán)節。DC可以在體外培養后用于體內免疫治療，也可 輔以細胞因子或其它因子如Flt-3等在體內擴增 ［1］ 。用DC疫苗進(jìn)行免疫治療已受到重視 ［2，3］ ，且成為當今生物治療領(lǐng)域備受關(guān)注的熱點(diǎn)課題，對樹(shù)突狀細胞疫苗的研究日趨深入而廣泛。
1 DC的基礎研究
1.1 DC的來(lái)源與分布 DC起源于骨髓CD34 + 細胞，廣泛分布于除腦以外的全身各臟器，數量極微，僅占外周血單核細胞（PBMC）的1%以下 ［4］ ，DC前體細胞由骨髓進(jìn)入外周血，再分布到全身各組織，根據移行至部位的不同而命名:（1）濾泡樹(shù)突狀細胞（FDC）主要定位于淋巴濾泡，是淋巴結淺皮質(zhì) 區淋巴濾泡內的主要APC，其樹(shù)突狀突起表面有FcγR和C3bR，能有效地捕捉復合形式的抗原，并將抗原長(cháng)期保留在其表面，以維持二級濾泡的記憶功能; （2）并指狀細胞（IDC）定位于淋巴組織胸腺依賴(lài)區，是淋巴組織胸腺依賴(lài)區的重要APC，其表面缺乏Ig受體和C3受體，但富含MHI類(lèi)和Ⅱ類(lèi)抗原; （3）朗罕氏細胞（LC）位于皮膚和胃腸上皮層，是這些部位的重要APC，其表面有豐富的MHI類(lèi)和Ⅱ類(lèi)抗原以及FcγR和C3bR，胞漿內有 birbeck顆粒;（4）隱蔽細胞（VC）分布于輸入淋巴管。
1.2 DC表面標志及功能 DC的抗原遞呈功能與MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，共刺激分子及粘附分子的表達密切相關(guān)。DC的表面標志可分為相應的抗原和受體。
表面抗原:包括MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類(lèi)分子，共刺激分子及粘附分子。MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類(lèi)分子能與抗原肽結合，把抗原和免疫復合物分別遞呈給 CD8 + 、CD4 + T淋巴細胞。CD54/ICAM-Ⅰ是淋巴細胞功能相關(guān)抗原l（LFA-1）的配體，參與抗原遞呈;CD58（LFA-3）與T淋巴細胞表面CD2受體相 結合，參與輔佐信號的產(chǎn)生和傳遞;白細胞共同抗原異構體（CD45RO）參與調節信號傳導;CD44參與T淋巴細胞的活化;CD40-CD40L參與B淋 巴細胞的活化、增殖的調節，提供上調DC表達B7的激活信號，同時(shí)也為輔助T淋巴細胞（Th細胞）產(chǎn)生IL-4、IL-5、干擾素（IFN-γ）提供信 號，并協(xié)調IL-12誘導T淋巴細胞產(chǎn)生IFN-γ ［5］ 。
表面受體:DC表面的FcR和CRl主要參與抗原性異物和免疫復合物的捕獲。DC表面存在I型人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV-1）受體―――DC- SIGN，其氨基酸序列與C型植物血凝素相同，能夠與T淋巴細胞表面的ICAM-3結合，介導DC與幼稚T淋巴細胞之間的結合，促進(jìn)HIV-l進(jìn)入CD4 + T淋巴細胞。人LC表面的神經(jīng)肽受體，可與神經(jīng)系統產(chǎn)生的神經(jīng)肽相結合，從而使DC的功能受神經(jīng)系統的調節。CDwl50（1PO-3）為共刺激受體，參 與信號轉導。
1.3 DC的分化發(fā)育 DC的來(lái)源和分化發(fā)育所處的階段與其功能有非常密切的關(guān)系，未成熟DC主要是攝取和加工處理抗原，成熟期DC則主要司職遞呈抗原并活化初始型T細胞。來(lái)源 于髓系的DC前體可發(fā)育為郎罕氏細胞，在細胞因子作用下可發(fā)育為成熟DC，也可先發(fā)育為單核細胞，再進(jìn)一步發(fā)育為成熟DC。髓系DC的主要功能為加工處理 和遞呈外源性抗原;淋巴系DC主要參與中樞和外周免疫耐受。終末分化的或成熟的DC有很強的免疫激活功能;未成熟DC啟動(dòng)免疫功能較差，但它們專(zhuān)門(mén)進(jìn)行攝 取和提呈抗原、合成MHC-多肽復合物。未成熟DC能表達一些膜受體FcγRⅡ，人甘露糖受體或小鼠DEC-205分子，這些受體能介導其攝取抗原。成熟 DC的特點(diǎn)是:（1）表達高水平多肽-MHC復合物;（2）表達高水平共刺激分子CD80、CD86、CD40、LFA-3/CD58、ICAM-l /CD54等;（3）能分泌IL-12，尤其是在CD40L作用下能分泌TH1型細胞因子 ［6］ 。
1.4 DC的鑒定及記數標志 目前對DC的鑒定主要依靠細胞形態(tài)，細胞表面共刺激分子以及CDla、CD83等來(lái)綜合鑒定。至今尚未發(fā)現DC的特異性標志。
CDla主要表達于胸腺細胞和DC，是鑒定人外周血與骨髓中DC的最好標記，也是對DC進(jìn)行計數的標志。Rouard等 ［7］ 發(fā)現CD83是DC成熟的標志，其激活T淋巴細胞功能最強。
Birbeck首先在人上皮組織中發(fā)現Birbeck顆粒，它是LC最可靠的形態(tài)學(xué)鑒別依據，為L(cháng)C特征性顆粒。Fascin是人外周血中另一個(gè)DCs的標志 ［8］ 。
2 DC在免疫治療中的應用
2.1 樹(shù)突狀細胞抗腫瘤的機制 DC參與抗腫瘤的主要可能機制為:（1）以腫瘤抗原體外沖擊致敏DC，可以保證DC對腫瘤抗原的攝取，同時(shí)DC提供高水平的協(xié)同刺激分子，激活T細胞，而 且DC與T細胞結合后，可通過(guò)分泌大量IL-12介導Th1型應答，利于消除腫瘤。（2）以基因工程的方法將目的基因導入DC，以調節或增強DC的抗原呈 遞功能，誘導抗腫瘤免疫。（3）DC的抗原多肽小體含有幾種胞漿蛋白及相關(guān)膜蛋白，MFG-E8是其主要成分，可能與小體的細胞靶向有關(guān);小體的另一成分 熱休克同源蛋白（HSC73）是體內抗腫瘤免疫的高效誘導分子 ［9］ 。（4）DC可通過(guò)吞噬凋亡的腫瘤細胞獲得腫瘤抗原而啟動(dòng)免疫應答。
2.2 DC腫瘤疫苗的種類(lèi)及其應用 腫瘤常規治療主要是外科手術(shù)、放療、化療等方法，其失敗的主要原因是因為其療效的非特異性，無(wú)法根除遠處轉移的微小病灶，而腫瘤免疫療法的主要目的是要發(fā) 展腫瘤疫苗，誘導機體的免疫系統來(lái)識別和清除其微小轉移灶。這種腫瘤疫苗被稱(chēng)為治療性疫苗。腫瘤抗原的免疫原性往往很弱，為了增強機體的免疫應答，將患者 自身的DC進(jìn)行培養并將腫瘤抗原導入DC，可以激發(fā)對腫瘤細胞的免疫反應，此即為以DC為基礎的腫瘤疫苗。
2.2.1 DC腫瘤細胞性抗原疫苗 該疫苗是以滅活的腫瘤細胞或裂解的腫瘤細胞成分直接對DC進(jìn)行體外沖擊，或者采用細胞融合技術(shù)荷載腫瘤抗原成分，從而制備出具有功能的成熟DC。將腎癌細 胞與同種異體樹(shù)突狀細胞融合后，對17例已轉移的腎癌患者進(jìn)行免疫治療的臨床實(shí)驗結果顯示 ［10］ ，4例患者出現完全應答，2例患者腫瘤縮小50%以上，2例患者病癥穩定。此疫苗，由于其腫瘤抗原易于獲取，因此，在臨床應用上具有較大的潛力，但也存在 一些缺點(diǎn):（1）需大量瘤體組織;（2）最佳刺激量難以掌握;（3）腫瘤細胞抗原成分中可能包含正常機體組織抗原，存在誘發(fā)自體免疫疾病的風(fēng)險。
2.2.2 DC腫瘤多肽抗原疫苗 該疫苗是應用弱酸洗脫的腫瘤抗原MHC-Ⅰ多肽，或合成的腫瘤抗原多肽沖擊DC而制成，具有更好的靶向性，并且抗原濃度大，能產(chǎn)生“沖擊致敏”的效應，促 進(jìn)T細胞的有效激活。Murphy等 ［11］ 應用2個(gè)HLA-A2特異性PSMA多肽（PSM-P1，P2）制備的DC腫瘤疫苗治療33例對激素治療無(wú)反應的前列腺癌，總陽(yáng)性反應率達30%，其中2 例完全應答，6例部分應答，50%的患者前列腺特異抗原表達下降，或者前列腺閃爍掃描顯示病變消退。此疫苗的最大優(yōu)點(diǎn)是能夠誘導機體產(chǎn)生靶向于腫瘤抗原多 肽的特異性CTL應答。然而，腫瘤的異質(zhì)性決定了同一腫瘤中的瘤細胞不會(huì )都表達所應用的抗原多肽，其遺傳的不穩定性，又易于導致對單一的特異性抗原產(chǎn)生耐 受;另外真正特異性的腫瘤抗原知之甚少，因此該類(lèi)疫苗只能對少數幾種腫瘤起作用，其臨床應用受到了一定限制。
2.2.3 DC腫瘤抗原mRNA疫苗 通過(guò)核酸擴增技術(shù)從來(lái)源有限的腫瘤組織中擴增到足量用于刺激DC的mRNA，并采用差異篩選方法獲得特異表達的腫瘤mRNA，以此作為抗原沖擊DC，制成 疫苗。Ashley等 ［12］ 用低免疫原性腫瘤B16-F10的總RNA致敏小鼠DC。在接種后，能誘導出特異的抗B16腫瘤CTL，延長(cháng)小鼠的生存時(shí)間，并能保護小鼠免受移植瘤的侵 襲。這種方法對于僅能得到少量瘤細胞的情況具有實(shí)用價(jià)值，也可避免自身抗原刺激DC誘發(fā)自身免疫性疾病的風(fēng)險。
2.2.4 DC基因修飾疫苗 用于修飾DC的基因可分為編碼TAA基因和細胞因子基因兩大類(lèi)?；蛐揎桪C瘤苗的優(yōu)點(diǎn)是:（1）與基于多肽或腫瘤細胞裂解物DC瘤苗相比，MHC結合抗 原表位在DC表面存留時(shí)間較長(cháng);（2）抗原交叉遞呈可同時(shí)刺激CD4 + 和CD8 + T細胞抗腫瘤免疫;（3）細胞因子基因修飾DC誘導的免疫應答強烈。編碼野生型p53基因的重組腺病毒載體轉導DC產(chǎn)生瘤苗，該瘤苗可使 85%的小鼠對攜帶相應抗原的腫瘤細胞產(chǎn)生抗腫瘤免疫 ［13］ 。用編碼IL-12基因重組缺陷腺病毒轉染小鼠骨髓源性DC，向小鼠結腸腺癌細胞株產(chǎn)生的癌結節注射該DC瘤苗后，50%～100%的病灶消退 ［14］ 。盡管基于DNA的DC瘤苗己成功用于小鼠模型，但在人類(lèi)臨床試驗中尚未發(fā)現明顯的治療效果 ［15］ 。此類(lèi)疫苗也有不足之處:（1）基因表達效率不高;（2）對載體病毒蛋白產(chǎn)生的免疫應答可影響DC成熟、誘導DC死亡等。
2.2.5 DC亞細胞結構腫瘤疫苗 DC能分泌一種小的抗原遞呈小體，其內包含MHCⅠ、Ⅱ類(lèi)分子和CD86，在體外能刺激抗原特異性CD8 + T細胞增殖。研究表明 ［16］ ，給荷瘤3～10天的小鼠一次性皮下注射5g的exosomes，可在小鼠體內誘導出高水平的CTL，并能治愈荷瘤小鼠。這提示了存在著(zhù)無(wú)細胞體誘導體內 免疫功能的途徑。
2.3 DC疫苗輸注途徑 DC疫苗注射途徑對誘導全身性免疫應答意義重大 ［17～19］ 。Morse等 ［20］ 對離體法獲得的癌癥病人DC歸巢能力研究發(fā)現，碘標記的單核細胞來(lái)源的DC分別采用靜脈、皮內或皮下注射途徑，結果靜脈注射途徑DC向肺、肝、脾歸巢，靜 脈或皮下達徑在淋巴結中未發(fā)現DC歸巢，只有皮內途徑于注射后48h在局部淋巴結發(fā)現少量（0.4%）DC歸巢。Nestle等 ［21］ 對16例進(jìn)展期惡性黑色素瘤局部淋巴結注射負荷腫瘤抗原的DC，結果所有病人出現DIH。Lambert等 ［17］ 發(fā)現腫瘤裂解物脈沖小鼠骨髓源性DC經(jīng)淋巴結內注射比皮下、靜脈途徑注射能產(chǎn)生更有效的抗腫瘤免疫，淋巴結內注射經(jīng)卵圓蛋白脈沖的DC后，誘導抗原特異性 T細胞增殖比皮下或靜脈途徑明顯增多，且Th1細胞介導的免疫應答更為強烈。Fong等 ［22］ 認為，皮內和淋巴管內注射DC誘導Th1細胞介導的免疫應答頻率比靜脈注射高，后者誘導特異性抗體頻率和滴度明顯比前二者高。
2.4 免疫反應監測 用于檢測特異性免疫應答的方法有細胞毒性試驗、流式細胞儀檢測效應性細胞因子釋放、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法、四聚體技術(shù)等。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法可以檢測到反應性效應細 胞的細胞因子釋放，該試驗靈敏度為1:100000細胞 ［18］ 。MHC四聚體染色法可在癌癥患者病變或淋巴結活檢標本中原位檢測肽段特異性 ［19］ ;可在血流或利用細針穿刺技術(shù)在組織中檢測免疫反應;在組織和次級淋巴器官中監測正在進(jìn)行中的免疫反應，能更好地洞悉免疫效應機制，目前主要是監測CTL 活性 ［23］ 。
3 問(wèn)題與展望
應用DC疫苗免疫治療腫瘤的研究已獲得了很大的成功，但現有 的各種DC疫苗均存在一定的缺陷和技術(shù)難度，DC疫苗介導的腫瘤免疫治療以何種方式最佳目前尚無(wú)定論。另一方面，在運用DC疫苗治療腫瘤的臨床Ⅰ、Ⅱ期試 驗中發(fā)現，盡管病員均能夠耐受，但部分病人存在自身免疫和（或）超敏反應等現象 ［24］ ，其安全性有待更細致、廣泛的觀(guān)察。
利用DC疫苗對人類(lèi)腫瘤進(jìn)行免疫治療已跨出可喜的第一步，今后對DC疫苗還需進(jìn)一步深入研究，新技術(shù)的發(fā)展必將找到克服現有各種DC疫苗缺點(diǎn)的方法，從而為腫瘤的免疫治療帶來(lái)新的突破。
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作者單位:1 310053浙江醫學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校
2 310006浙江大學(xué)醫學(xué)院基礎醫學(xué)系
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