HPLC 2009-11-01 21:19:45 閱讀532 評論4 字號：大中小 訂閱
| 高效液相色譜級乙腈的質(zhì)量評價(jià) |
| 信息來(lái)源：液色迷人 |
| 摘要: 高效液相色譜（HPLC）分析中，流動(dòng)相溶劑的純度和質(zhì)量對分析結果和儀器本身都有重要影響。溶劑中的各種痕量雜質(zhì)不僅會(huì )造成較高的基線(xiàn)和鬼峰，進(jìn)而影響定性定量分析結果，而且可能會(huì )污染分離柱和堵塞系統，造成儀器出現故障。了解HPLC溶劑規格和相關(guān)的測試方法，可以幫助HPLC 用戶(hù)評價(jià)和篩選HPLC溶劑，減少溶劑雜質(zhì)對應用造成的負面影響。本文介紹了基于紫外（UV）吸收和HPLC梯度確定HPLC級乙腈純度和質(zhì)量的兩種規范方法及其對HPLC分析的意義，并探討了這兩種方法的實(shí)際應用。 乙腈區別于其他HPLC溶劑的獨特性質(zhì)（中等洗脫能力、強溶解能力、能夠得到明確的色譜峰、低粘度、相對于醇類(lèi)和酯類(lèi)有較低的UV吸收）[1]，使其成為 最常用的有機流動(dòng)相組分。乙腈一般是（由氨和丙烯）大規模生產(chǎn)丙烯腈的副產(chǎn)物。其中可能含有多種很少量的雜質(zhì)，例如丙烯腈、α(β)-甲基丙烯腈、順/反 式丁烯腈、乙醛、丙酮、甲醇、乙基氰化物、丙烯醛、烯丙醇、丙烯酸、惡唑和乙酸[2-4]。經(jīng)過(guò)復雜的純化過(guò)程，痕量的上述雜質(zhì)可能仍然存在于HPLC級 乙腈中。其中一些雜質(zhì)不僅會(huì )造成較高的基線(xiàn)和鬼峰，進(jìn)而影響定性定量分析，而且會(huì )污染分析柱、堵塞系統，導致儀器出現故障。 作為美國分析試劑標準測試方法的權威，美國化學(xué)學(xué)會(huì )（ACS）分析試劑委員會(huì )在《試劑化學(xué)品》（第9版）中明確定義了HPLC級乙腈的技術(shù)說(shuō)明，包括通用 的說(shuō)明和HPLC的適用說(shuō)明。通用的說(shuō)明包括氣相色譜（GC）純度、水、滴定酸或堿、以及揮發(fā)殘留物。HPLC的適用說(shuō)明包括UV吸收和HPLC空白梯度 洗脫基線(xiàn)[5]。 本文詳細介紹了乙腈的兩種適用于HPLC的規范方法及其對HPLC應用的意義，并通過(guò)詳盡的實(shí)驗數據討論了操作中的注意事項以及影響測試結果的因素。 1 實(shí)驗 1.1 儀器 本文中使用了兩種HPLC系統，其特定條件介紹如下：Agilent 1100 HPLC系統由脫氣機（G1379A）、四元泵（G1311A）、自動(dòng)進(jìn)樣器（G1315A）和二極管陣列檢測器（DAD）（G1315B） （Agilent Technologies, Wilmington, DE）組成，并用該系統獲得圖1和圖2的結果。其他色譜圖由Alliance 2695 HPLC系統和2996 光電二極管陣列（PDA）檢測器(Waters, Milford, MA)獲得。ZORBAX C18柱由Agilent提供；B&J C8柱從Honeywell Burdick & Jackson獲得。  UV光譜使用Cary 4000 UV-VIS 分光光度計（Varian, Palo Alto, CA）。參比池為1 cm石英池，樣品池為1 cm或5 cm石英池。 1.2 藥品和試劑 HPLC級乙腈來(lái)自Honeywell Burdick & Jackson 及其他HPLC溶劑供應商。高純水由Milli-Q超純水系統（Millipore, Bedford, MA）和Honeywell Burdick & Jackson供應。乙酸（AR）由Sigma（St. Louis, MO）提供。 2 結果和討論 2.1 HPLC級乙腈UV吸收規范的意義 UV吸收背景對HPLC乙腈的關(guān)鍵性源于兩個(gè)原因。首先，大部分有機雜質(zhì)都會(huì )產(chǎn)生UV吸收。乙腈的UV吸收越小意味著(zhù)其中雜質(zhì)含量越少。第二，HPLC儀器最常用的檢測模式就是UV檢測。因此乙腈的UV吸收越小，色譜的基線(xiàn)背景越低；從而靈敏度越高，檢測限越低。 圖3是來(lái)自不同供應商的HPLC級乙腈的UV光譜，尤其是在短波長(cháng)范圍（300~190 nm）并不相同。這可能是由于乙腈中難以去除的雜質(zhì)因各溶劑供應商使用的純化技術(shù)不同而不同。鑒于使用UV檢測器的HPLC分析中大部分分析物在300 nm以下檢測，因此大部分溶劑供應商在上述波長(cháng)范圍內設立UV吸收規范。  2.2 影響UV吸收測量值的因素 在測試實(shí)驗中，很多因素會(huì )影響UV吸收的測量值： ?。?）光路距離（比色皿長(cháng)）。在0.2~0.8 AU范圍內，吸光率（A）的測量值誤差最小，否則吸光率的測量誤差會(huì )相對大些。如使用1 cm比色皿，即使在250～210 nm的短波長(cháng)范圍內，乙腈的吸光率也遠小于0.2 AU，因此可能產(chǎn)生很大的誤差。根據比爾定律，溶劑的吸光率和樣品的光路距離成正比，因此增加樣品池長(cháng)度會(huì )使溶劑吸光率增加，使其值進(jìn)入0.2~0.8 AU范圍內，從而減小測量誤差。使用5 cm比色皿，在400~190 nm掃描范圍內得到不同乙腈樣品的UV光譜（如圖4所示）。從圖4中曲線(xiàn)可以發(fā)現，使用5 cm比色皿可使乙腈在低波長(cháng)的大部分UV吸光率進(jìn)入0.2~0.8 AU范圍，從而顯示出數據的準確度更高。而且，不同乙腈樣品的UV吸光率的差別與使用1 cm比色皿時(shí)相比更明顯。鑒于這一點(diǎn)，Honeywell Burdick & Jackson等一些生產(chǎn)商使用1 cm和5 cm兩種比色皿建立UV吸收規范。  ?。?）儀器參數。由于乙腈的吸光率非常低，儀器參數的設定要保證最佳的靈敏度和準確度。雙光路模式可以克服單光路模式中光源能量隨時(shí)間變化的缺點(diǎn)，并且可以更方便地掃描UV全波長(cháng)范圍。使用分光光度計的基線(xiàn)校正功能，可以去除由光源、檢測器和樣品池等引入的儀器變化[6]。由于儀器噪聲隨著(zhù)掃描速度的提高 而增大，因此推薦使用最大掃描速度的一半。 ?。?）參比物。用于溶劑UV吸收測定的參比物有兩種可能?！对噭┗瘜W(xué)品》（第9版）使用水作為參比；而《中國藥典》使用空氣作為參比。使用空氣作為參比時(shí)測定的乙腈UV吸收值低于使用水作為參比時(shí)測定的值，而且在400~250 nm波長(cháng)的范圍內通常為負值。這是由于空氣中氧和二氧化碳的貢獻使其UV吸收強于水。如圖5中所示，由于參比不同造成的UV吸收有顯著(zhù)不同，高達 0.03 AU，所以當我們閱讀供應商提供的分析報告證書(shū)時(shí)需要了解究竟是使用水還是使用空氣作為參比。  推薦使用新鮮的HPLC級瓶裝水或者實(shí)驗室超純水系統制得的超純水作為參比物。值得注意的是，實(shí)驗室超純水系統制得的新鮮水常常含有大量的氣泡，這些氣泡需要在實(shí)驗前去除，否則會(huì )影響數據的準確度。 ?。?）氮氣噴霧。為了延長(cháng)溶劑的保存時(shí)間，一些HPLC溶劑供應商將惰性氮氣充入溶劑。作者研究了氮氣對乙腈UV吸收的影響（圖6）。結果發(fā)現經(jīng)過(guò)氮氣噴 霧，乙腈在250~200 nm范圍內的UV吸收顯著(zhù)降低。200 nm處的吸光率為0.012，是氮氣噴射前的四分之一。其原因可能是氮氣在乙腈中的溶解度遠小于氧氣和二氧化碳。氮氣噴霧減少了氧氣和二氧化碳對乙腈UV 吸收的貢獻。（注意：也可能是由于氧氣和溶劑形成了電荷傳遞復合物導致了UV吸收。）  ?。?）溶劑的揮發(fā)性。由于乙腈是一種揮發(fā)性溶劑，如果樣品池和參比池在測試過(guò)程中是敞開(kāi)的，那么樣品池中的乙腈蒸汽可能會(huì )進(jìn)入樣品室或參比池，結果造成吸光率讀數偏低。因此，推薦在實(shí)驗中用聚四氟乙烯（PTFE）蓋子將這兩個(gè)池都蓋住。 2.3 HPLC級乙腈空白梯度洗脫規范的意義 如果溶劑中的雜質(zhì)水平低于1 ppm，簡(jiǎn)單的UV光譜通常檢測不到其存在[1]。然而，這些痕量雜質(zhì)可能在有機相和水相比例較低時(shí)在柱上富集并保留，然后當梯度過(guò)程中流動(dòng)相洗脫能力增強時(shí)被洗脫下來(lái)，從而形成鬼峰[7]。因此，HPLC空白梯度洗脫基線(xiàn)上的鬼峰高低，是評價(jià)HPLC級乙腈質(zhì)量的關(guān)鍵規范方法。它清楚地表明了乙腈中是否 含有影響梯度洗脫模式下HPLC分析的痕量的雜質(zhì)。 《試劑化學(xué)品》（第9版）明確規定214 nm處HPLC空白梯度洗脫基線(xiàn)的最大峰高應低于5 mAU。具體的測定方法如下：C18柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；梯度：0 min，80% 水（溶劑A），20% 乙腈（溶劑B），保持30 min；在50 min時(shí)達到 100% B，保持10 min；流速2 mL/min。樣品運行3次，并去掉第1次運行的結果[5]。圖7比較了B&J ACS/HPLC和幾種國內色譜級乙腈樣品的ACS空白梯度洗脫基線(xiàn)。結果表明，一些本地產(chǎn)色譜級乙腈樣品在254 nm時(shí)會(huì )產(chǎn)生高達20 mAU的鬼峰。這說(shuō)明即使在254 nm處，這些國產(chǎn)試劑也可能在HPLC常規分析中產(chǎn)生干擾。  在HPLC的一些實(shí)際應用中，往往需要在更低波長(cháng)處使用梯度洗脫模式以實(shí)現高靈敏度的HPLC分析，因此對乙腈的HPLC空白梯度洗脫規范提出了更高的要 求。為了滿(mǎn)足高靈敏HPLC應用的要求，一些溶劑供應商也生產(chǎn)梯度級HPLC乙腈。這種乙腈不同于用于等度洗脫HPLC分析的乙腈，它們可以滿(mǎn)足更嚴格的 梯度洗脫規范。例如，Honeywell Burdick & Jackson的空白梯度洗脫基線(xiàn)規格為：254 nm時(shí)低于1 mAU，215 nm時(shí)低于5 mAU。圖1中，在215 nm下，不同供應商的梯度級乙腈的梯度洗脫基線(xiàn)不同，說(shuō)明它們用于低波長(cháng)梯度洗脫模式痕量HPLC分析的質(zhì)量不同。 2.4 影響空白梯度洗脫基線(xiàn)測定的因素 由于操作和HPLC系統本身的復雜性，系統中的任何部分都可能成為梯度洗脫基線(xiàn)鬼峰的來(lái)源，因此在實(shí)驗過(guò)程中應十分注意降低HPLC系統和水相的干擾。 ?。?）HPLC系統污染和流動(dòng)相添加劑的影響。梯度洗脫過(guò)程中，任何有UV吸收的雜質(zhì)都可能產(chǎn)生鬼峰。除了HPLC進(jìn)樣系統和色譜柱的污染，樣品溶劑和流 動(dòng)相的不匹配也會(huì )產(chǎn)生鬼峰。圖8為當100%乙腈樣品進(jìn)入系統中，乙腈和水梯度運行色譜圖中開(kāi)始處可能產(chǎn)生正或負的鬼峰。因此進(jìn)行空白梯度洗脫基線(xiàn)測定 時(shí)，為了去除可能來(lái)自進(jìn)樣系統的干擾而不予以進(jìn)樣。測試前色譜柱應徹底洗凈，或者使用一根專(zhuān)門(mén)用來(lái)做這個(gè)實(shí)驗的色譜柱來(lái)避免來(lái)源于色譜柱的交叉污染。 HPLC分析的實(shí)際應用中，常向流動(dòng)相中加入一些添加劑來(lái)改善分離和峰形。然而，這些添加劑也可能成為梯度洗脫基線(xiàn)鬼峰的來(lái)源。圖9中可見(jiàn)，水相中加入乙酸會(huì )導致梯度洗脫基線(xiàn)中有鬼峰。因此，乙腈空白梯度洗脫基線(xiàn)測定操作中，只用水和乙腈作為流動(dòng)相而不加添加劑。 ?。?）HPLC系統中氣泡的影響。溶劑中的氣泡經(jīng)過(guò)HPLC系統也可能產(chǎn)生鬼峰（圖10）。這種鬼峰和典型的雜質(zhì)峰不同，它們是魚(yú)翅形：其前邊緣很銳，然 后幾乎線(xiàn)性下降至基線(xiàn)。在線(xiàn)壓力監測系統顯示，鬼峰形成時(shí)有很快的系統壓力降（圖11），更進(jìn)一步證明這些鬼峰的形成是由于系統壓力的瞬間快速降低而不是 由于雜質(zhì)的存在。參考文獻[7]和[8]詳細解釋了氣泡如何導致了這種鬼峰的生成。 因此，當進(jìn)行空白梯度洗脫測試時(shí)，需要確保HPLC系統中的氣泡完全除凈、脫氣機正常工作并且流動(dòng)相充分脫氣，從而保證系統中沒(méi)有氣泡。 ?。?）流動(dòng)相中水的影響。水相也是空白梯度洗脫基線(xiàn)中鬼峰的一個(gè)重要來(lái)源。實(shí)際上，空白基線(xiàn)洗脫基線(xiàn)中的大部分鬼峰來(lái)源于水相[9]。在消費者處進(jìn)行的一 次HPLC梯度洗脫基線(xiàn)操作中發(fā)現使用不同品牌的乙腈時(shí)，17.5 min處都有一個(gè)很高的鬼峰，說(shuō)明這是由消費者的水凈化系統引起的（圖2）。許多分析實(shí)驗室常使用商品化飲用水或蒸餾水作為HPLC分析的流動(dòng)相。實(shí)際 上，水的塑料容器常會(huì )促進(jìn)細菌的生長(cháng)，容器中的添加劑也可能會(huì )溶入水中，從而導致梯度洗脫模式中出現鬼峰。因此，推薦使用由HPLC溶劑供應商提供的商品 化瓶裝HPLC級水，或超純水系統制備的用于HPLC的水。圖12表明新鮮的B&J ACS/HPLC水和來(lái)自Milli-Q系統的超純水都能滿(mǎn)足高靈敏度HPLC梯度洗脫測試規格。 但應該注意的是，空氣中的污染物也可能進(jìn)入到瓶裝HPLC水中，一旦蓋子打開(kāi)一段時(shí)間后可能會(huì )長(cháng)菌。圖12顯示，開(kāi)瓶一周的棕色瓶裝HPLC水的梯度洗脫 基線(xiàn)嚴重漂移，并且相比于新鮮HPLC水，其峰的數量和峰高都顯著(zhù)增加。因此，瓶裝HPLC級水一旦打開(kāi)，最好在兩天內使用。至于Milli-Q超純水， 應注意的是超純水系統中的柱子和UV燈是消耗品，當到達使用壽命時(shí)需要更換;否則水中的總有機碳（TOC）可能顯著(zhù)增加，從而在梯度洗脫測試中產(chǎn)生干擾 [9]。 為避免柱內的流動(dòng)相“疏水性塌陷”，梯度洗脫中初始流動(dòng)相組成不使用100%水，而使用較低的有機相/水相比例（根據不同的HPLC溶劑供應商，通常為 10%~30%乙腈）。如果鬼峰是由流動(dòng)相造成的，峰高會(huì )隨著(zhù)初始有機相/水相比例的持續時(shí)間而變大。為了進(jìn)一步確定鬼峰是來(lái)自乙腈或水，可以改變初始有機相的比例。如果鬼峰隨著(zhù)初始有機相比例增大而增大，那么其來(lái)源應為乙腈；反之則來(lái)源于水。圖13中，鬼峰高隨著(zhù)平衡時(shí)間增加，所以這些鬼峰全部來(lái)自于流動(dòng)相。如果考察不同初始有機相比例的兩個(gè)梯度洗脫基線(xiàn)，當初始有機相比例從20%增至30%時(shí)，48~52 min范圍內的鬼峰增多，40~46 min范圍內的鬼峰消失。這說(shuō)明前一個(gè)來(lái)源是乙腈而后一個(gè)是水。 ?。?）過(guò)濾造成的流動(dòng)相污染。為了避免流動(dòng)相中可能存在的顆粒造成HPLC系統堵塞，HPLC儀器供應商通常推薦對流動(dòng)相進(jìn)行微過(guò)濾。然而，操作不小心或者微過(guò)濾裝置本身都可能會(huì )向流動(dòng)相中引入雜質(zhì)。一方面，商品化過(guò)濾膜的質(zhì)量差別很大，并且（尤其是用尼龍或高密度聚乙烯制作的）過(guò)濾膜本身可能引入更多顆 ?；蚝锌杀灰译孑腿〉奈镔|(zhì)；另一方面，一般的實(shí)驗室條件下，很難保證過(guò)濾過(guò)程中過(guò)濾裝置的玻璃器皿部分完全沒(méi)有顆粒。使用0.45 μm尼龍支撐的的疏水PTFE膜過(guò)濾乙腈，空白梯度洗脫基線(xiàn)中45 min處會(huì )出現高達50 mAU的鬼峰（圖14）。盡管污染的來(lái)源還需要進(jìn)一步確認，這仍可說(shuō)明實(shí)驗室中微過(guò)濾操作引起污染的風(fēng)險很高。因此，推薦在HPLC梯度洗脫評價(jià)測試中直 接使用由生產(chǎn)商提供的原裝瓶里的乙腈，而不增加其他處理操作。 3 結論 UV吸收和HPLC空白梯度洗脫基線(xiàn)是HPLC級乙腈的兩個(gè)關(guān)鍵規格。由于UV區域內乙腈的吸收很低，推薦使用雙光路模式、基線(xiàn)校正和適當增加比色皿長(cháng)度來(lái)獲得更加準確的結果。另外，參比物質(zhì)、溶劑是否經(jīng)過(guò)氮氣噴射以及溶劑本身的揮發(fā)性也可能影響測試結果。相比于UV吸收，HPLC空白梯度洗脫基線(xiàn)評價(jià)可 以為應用于HPLC梯度的乙腈質(zhì)量提供更加精確和實(shí)用的評價(jià)。測試中需要考慮多種實(shí)際方面來(lái)確保獲得準確可靠的測試結果；來(lái)自于HPLC系統、流動(dòng)相添加 劑和水相的污染，以及附加的過(guò)濾操作都需要避免；系統中的氣泡也要除凈。 |
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