中文字幕一区二区三区夜色视频_ 文獻解讀|circAGFG1通過(guò)miR-195-5p調控CCNE1的表達促進(jìn)三陰性乳腺癌的發(fā)展

本文解讀的文獻標題如下

The circRNA circAGFG1 acts as a sponge of miR-195-5p to promote triple-negative breast cancer progression through regulating CCNE1 expression

通過(guò)高通量測序和后續的功能驗證，挖掘出三陰性乳腺癌中的一個(gè)ceRNA調控功能網(wǎng)絡(luò )，網(wǎng)址如下

https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-018-0933-7

三陰性乳腺癌是最為惡性的一種乳腺癌亞型，占所有乳腺癌病理類(lèi)型的15%左右，對應癌組織的免疫組織化學(xué)檢驗結果為雌激素受體(ER), 孕激素受體(FR), 原癌基因(Her-2)三者均為陰性，其名稱(chēng)也由此而來(lái)，簡(jiǎn)稱(chēng)TNBC。該疾病在年輕女性中更為常見(jiàn)，由于缺少相應的分子靶點(diǎn)研究，化療是目前唯一有效的治療方式，但是復發(fā)率高，而且預后效果差。

環(huán)狀RNA是一類(lèi)新星的非編碼RNA,具有重要調控功能，相關(guān)研究表明，環(huán)狀RNA在多種疾病，尤其是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。環(huán)狀RNA可以作為miRNA sponge, 與miRNA結合，從而和該miRNA的其他靶標分子形成競爭關(guān)系，構成ceRNA調控網(wǎng)絡(luò )，關(guān)于ceRNA機制的研究在多種癌癥中被報道。

本文以環(huán)狀RNA在三陰性乳腺癌中的作用為切入點(diǎn)，嘗試去尋找相應的分子靶點(diǎn)，綜合了高通量測序，TCGA公共數據挖掘，功能驗證等多種手段來(lái)進(jìn)行分析，概括如下

1. 環(huán)狀RNA表達譜分析

首先從4個(gè)TNBC患者采集了癌和癌旁組織進(jìn)行RNA_seq測序，構建去rRNA的文庫，進(jìn)行mRNA和circRNA的表達譜分析。對于環(huán)狀RNA表達譜，以fold change 大于2，p值小于0.05為閾值，篩選出了354個(gè)差異表達的環(huán)狀RNA, 其中47個(gè)上調，307個(gè)下調，火山圖結果如下

根據fold change分別從上調和下調的環(huán)狀RNA中挑選10個(gè)最顯著(zhù)的環(huán)狀RNA繪制熱圖，結果如下

其中hsa_circ_9958514是差異最大的，fold change為15.04，該環(huán)狀RNA來(lái)源于A(yíng)GFG1基因，來(lái)circBase數據庫中有詳細注釋?zhuān)暨x這個(gè)環(huán)狀RNA進(jìn)行后續驗證。

2. mRNA表達譜分析

對于mRNA的表達譜，相同的閾值篩選出了3225個(gè)差異的mRNA,其中1007個(gè)上調，2218個(gè)下調，同樣的方法挑選20個(gè)差異的mRNA,熱圖如下所示

其中CCNE1這個(gè)基因的表達量差異最大，fold chang為19.36, 所以后續鎖定這個(gè)基因來(lái)進(jìn)行驗證。

對于差異基因，通過(guò)KEGG富集分析和GSEA兩種方法分析富集到的通路，結果如下所示

兩種結果中，都顯示cell cycle這個(gè)通路被富集到。

3. 候選環(huán)狀RNA的驗證

通過(guò)PCR驗證circAGFG1的存在, 并進(jìn)行一代測序，獲得該環(huán)狀RNA的序列信息，結果如下如下，其中527bp就是該環(huán)狀RNA的轉錄本長(cháng)度，和circBase數據庫中的記錄一致

通過(guò)qRT-PCR驗證環(huán)狀RNA的差異，采用40個(gè)病人配對的癌和癌旁組織，共80個(gè)樣本進(jìn)行驗證，結果如下

通過(guò)circAGFG1的表達量區分正常組織和癌組織，對應的ROC曲線(xiàn)如下所示

AUC大于0.5，說(shuō)明可以有效的區分正常組織和癌組織。

通過(guò)生存分析發(fā)現circAGFG1的表達量與患者生存時(shí)間呈負相關(guān)關(guān)系，生存曲線(xiàn)如下

通過(guò)cox回歸分析，發(fā)現了TNM和circAGFG1的表達量這兩個(gè)因素與生存時(shí)間顯著(zhù)相關(guān)，結果如下

通過(guò)卡方檢驗分析circAGFG1和病人臨床特征之間的相關(guān)性，結果如下

T和N對應的p值小于0.05，即環(huán)狀RNA與原發(fā)部位腫瘤大小，淋巴結轉移情況相關(guān)。

3. 候選基因的驗證分析

對于選定的CCNE1基因，首先通過(guò)RT-PCR驗證差異，結果如下

利用TCGA數據庫中收集的TNBC和正常組織的樣本，進(jìn)行差異分析和生存分析，結果如下

通過(guò)泊松相關(guān)分析探究circAGFG1和CCNE1之間的相關(guān)性，結果如下

發(fā)現二者成正相關(guān)關(guān)系。由于circAGFG1和CCNE1之間的正相關(guān)性，推測通過(guò)ceRNA機制來(lái)調控疾病過(guò)程。

4. circAGFG1和miRNA的相互作用分析

通過(guò)ArrayStar提供的mirna結合位點(diǎn)預測軟件預測circAGFG1結合的miRNA, 發(fā)現circAGFG1與miRNA-195-5p存在結合，結果如下

然后通過(guò)熒光原位雜交FISH技術(shù)，定位miRNA-195-5p和circAGFG1在細胞質(zhì)中，結果如下所示

再通過(guò)雙熒光素酶報告基因檢測系統驗證環(huán)狀RNA和miRNA之間的結合，野生型質(zhì)粒中熒光值相對下調，證明circAGFG1和miR-195-5p存在直接的相互作用。

進(jìn)一步通過(guò)設計circAGFG1 pull down芯片，驗證和miRNA的結合，結果如下

相比對照探針，在circAGFG1探針富集結果中檢測到了對應的環(huán)狀RNA和miRNA。

對于找到的miRNA-195-5p, 同樣做了RT-PCR驗證，發(fā)現在腫瘤中表達量下調，結果如下

同時(shí)利用TCGA的數據，也進(jìn)行了該miRNA的差異分析和生存分析，結果如下

TCGA的分析結果和自己的數據是一致的，都是下調，生存分析顯示miR-195-5p和生存時(shí)間正相關(guān)。

5. mRNA和miRNA相互作用分析

根據TargetScan的分析結果，CCNE1和miRNA-195-5p存在相互作用，同樣通過(guò)雙熒光素酶報告基因檢測系統來(lái)驗證，結果如下

6. ceRNA關(guān)系驗證

分別驗證了circRNA-miRNA和mRNA-miRNA的相互作用之后，進(jìn)一步驗證circRNA和mRNA的調功關(guān)系，通過(guò)敲低和過(guò)表達circAGFG1, 利用RT-PCR研究circAGFG1和CCNE1表達量的關(guān)系，結果如下

在兩種不同的TNBC組織中，候選的circRNA和mRNA都呈現正相關(guān)關(guān)系。

通過(guò)以上的各種證據，表明了circAGFG1,miR-195-5p,CCNE1三者之間確實(shí)構成了一個(gè)ceRNA調控關(guān)系。后續該文章還通過(guò)各種功能試驗進(jìn)一步驗證和挖掘了ceRNA在該腫瘤中的作用機制，這里就不展開(kāi)了。

通過(guò)這篇文獻，大概總結出ceRNA分析和驗證的一個(gè)思路

通過(guò)RNA_seq數據分析初步確定候選的各種RNA分子
結合TGGA公共數據庫的結果和自己的測序數據相互印證
對于數據分析得到的差異表達趨勢，通過(guò)RT-PCR驗證
對于miRNA的靶標關(guān)系，通過(guò)雙熒光素酶報告基因檢測系統進(jìn)行驗證
對于ceRNA分子表達量上的相關(guān)性，通過(guò)knock down和overexpression進(jìn)行驗證

生信分析作為整個(gè)思路的第一環(huán)，其結果的可靠性和準確性尤為重要。

·end·

本站僅提供存儲服務(wù)，所有內容均由用戶(hù)發(fā)布，如發(fā)現有害或侵權內容，請點(diǎn)擊舉報。