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2017年諾貝爾化學(xué)獎得主、美國國家科學(xué)院院士、美國哥倫比亞大學(xué)Joachim Frank教授曾多次到訪(fǎng)清華，此次巔峰對話(huà)以線(xiàn)上會(huì )議方式向同學(xué)們講解冷凍電鏡的前世今生，帶領(lǐng)大家領(lǐng)略原子維度的重構藝術(shù)，并針對學(xué)生挑戰團隊的提問(wèn)進(jìn)行解答。清華大學(xué)生命學(xué)院院長(cháng)、化學(xué)-生物大類(lèi)首席教授王宏偉老師作為對話(huà)嘉賓出席活動(dòng)。
文稿 | 阿希姆·弗蘭克、劉鐘靈 、周珩
編輯 | 于億航、周圣鈞、胡筱箐、姜晶博、高松齡、邱雨浩
審核 | 趙鑫、張可人
圖片來(lái)源：劉鐘靈 、周珩拍攝特別感謝清華大學(xué)研究生會(huì )劉鐘靈 、周珩提供的文稿、圖片！
人物簡(jiǎn)介
阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）教授，德裔生物物理學(xué)家，美國國家科學(xué)院院士，現任美國哥倫比亞大學(xué)教授，研究領(lǐng)域包括生物化學(xué)、分子生物物理學(xué)等。1975年到2008年間，弗蘭克教授完善了電子顯微鏡圖像處理的單顆粒算法，發(fā)明了SPIDER軟件，該軟件至今為全世界上百家實(shí)驗室廣泛使用。弗蘭克教授應用冷凍電鏡和單顆粒技術(shù)，在解析原核和真核細胞核糖體結構和功能領(lǐng)域做出了非凡的貢獻。弗蘭克教授在2017年10月獲得諾貝爾化學(xué)獎，以表彰他在“冷凍電鏡，用于生物分子結構的高分辨率解析”做出的巨大貢獻。
01 冷凍電鏡誕生發(fā)展的歷程
提到冷凍電鏡的誕生歷程，故事還得從一個(gè)動(dòng)物細胞講起?；谶€原論（Reductionism，在生物學(xué)領(lǐng)域可理解為將生命過(guò)程還原為分子運動(dòng)規律、物理-化學(xué)過(guò)程），要理解生命，則要更進(jìn)一步到達分子的層面。1998年Bruce Alberts提出了“分子機器”（molecular machine）概念：細胞內分子并非散亂碰撞，而是通過(guò)組裝井然有序地行使功能。ATP合成酶、蛋白酶體、分子伴侶、剪接體，以及Frank教授實(shí)驗室的主要研究對象——核糖體等，都是分子機器。我們既希望了解分子機器的組分結構，也希望知道組分間動(dòng)態(tài)互作的方式。
在冷凍電鏡技術(shù)誕生前的1968年，Frank教授當時(shí)還是一名研究生，Walter Hoppe和Max Perutz組織了一次X-ray crystallography 和EM of proteins領(lǐng)域的交流會(huì )，席間有Richard Henderson、Hugh Huxley、Nigel Unwin等人出席。由此可見(jiàn)，為解析更多生物大分子的組分與結構，此時(shí)X射線(xiàn)晶體學(xué)和蛋白電子顯微技術(shù)領(lǐng)域的交流已經(jīng)十分頻繁了。
X射線(xiàn)晶體學(xué)是解析生物大分子結構的老牌手段，但其弊端在于無(wú)法觀(guān)測分子的多種構象或結合狀態(tài)、樣品量需求大，最大的問(wèn)題是許多分子并不形成規律晶體。電子顯微鏡技術(shù)也可用于解析分子結構，但要求樣品極薄，且高能電子會(huì )損傷分子結構，最終得到的二維圖像是分子的投影。
那么，是否可以利用二維投影獲得三維重構呢？在1968年至1975年間，出現了三篇開(kāi)創(chuàng )性的工作：1968年，劍橋MRC實(shí)驗室的Aaron Klug和De Rosier獲得了T4噬菌體尾部的三維結構；1971年，Tony Crowther獲得了番茄叢矮病毒的三維結構；1975年，Richard Henderson和Nigel Unwin獲得了細菌紫紅質(zhì)的三維結構。但前兩項工作均利用了分子的特殊對稱(chēng)性，后一項工作只能適用于少數能夠生長(cháng)為二維晶體的分子，其方法均不具有普適性。
Frank教授當時(shí)的導師Walter Hoppe認為，三維重構并不一定要求分子具有特殊對稱(chēng)性或生長(cháng)為晶體，對于沒(méi)有對稱(chēng)性的分子，也可以通過(guò)拍攝多角度的電子顯微照片，獲取多個(gè)角度的投影進(jìn)行三維重構，即電子斷層掃描技術(shù)。但Frank通過(guò)計算發(fā)現，這種方法累積的電子劑量將對分子造成嚴重的輻照損傷，使得重構毫無(wú)意義。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步思考，Frank進(jìn)而提出了單顆粒三維重構的概念：經(jīng)過(guò)提純后的分子在溶液中有很多拷貝，它們可能包含各種自然構象，其空間取向也是隨機的，一張圖像即可囊括該分子很多空間取向；當我們獲取足夠多的圖像之后，就可以獲得該分子所有方向的投影以完成三維重構。在提出這一方法之后，Frank又與Saxon合作，在理論上證明了這一方法的可行性，但阻礙課題進(jìn)展的還有很多技術(shù)性難題。Frank領(lǐng)導開(kāi)發(fā)了第一個(gè)單顆粒三維重構的軟件包SPIDER，并不斷納入新的計算工具，以攻克這些技術(shù)難題。
有了好的計算工具，還需要有好的測試樣品。在1980年一次關(guān)于單顆粒技術(shù)的講座中，一位名為Miloslav Boublik的參會(huì )者向Frank教授展示了其拍攝到的Hela細胞核糖體清晰的電子顯微圖像。核糖體具有相對穩定的構象和適當的大小， Frank教授意識到這正是最佳的測試樣品。在當時(shí)，人們對核糖體的結構知之甚少，也沒(méi)有可靠的三維重構方法，僅有Jim Lake對核糖體進(jìn)行“肉眼重構”的粗略的三維模型。Frank教授繼而以核糖體為研究對象，在1979-1986年間開(kāi)發(fā)出隨機圓錐傾斜（Random Conical Tilt）三維重構方法，最終在1986年獲得了大腸桿菌核糖體50S亞基的三維結構，使三維重構技術(shù)走向實(shí)用。
2012年以前，冷凍電鏡的分辨率曾一度受制于傳統的CCD探測器和攝影膠片；2012年，直接電子探測相機的成功開(kāi)發(fā)，使得相機的量子探測效率（Detection Quantum Efficiency）大幅提高，開(kāi)啟了“分辨率革命”，帶領(lǐng)冷凍電鏡技術(shù)進(jìn)入新紀元。Frank教授分享了多個(gè)在此之后分辨率達到3?左右的精彩解析案例。教授指出冷凍電鏡技術(shù)不僅可以幫助我們預測mRNA和tRNA結合情況、定位分子結合位點(diǎn)等，在本次新冠疫情中，冷凍電鏡技術(shù)也極大程度幫助科學(xué)家確定了新型冠狀病毒SARS-CoV2與人體細胞受體結合以及與抗體結合的結構，助力快速鑒定病毒的突變與進(jìn)化。近年來(lái)，每年利用冷凍電鏡技術(shù)解析的生物大分子結構數量已經(jīng)超越了核磁共振，并仍在迅猛攀升。
目前冷凍電鏡技術(shù)依舊在革新之中，Frank教授以團隊最近的核糖體翻譯終止過(guò)程研究為例，講述時(shí)間分辨的冷凍電鏡技術(shù)（Time-resolved cryo-EM）結合精確控制的噴霧-混合系統可捕捉非常迅速的蛋白質(zhì)構象變化；圖像處理方法流形嵌入（Manifold Embedding）可以分辨出更為細致的動(dòng)力學(xué)變化，進(jìn)而實(shí)現對生物分子連續的結構變化過(guò)程的研究。
冷凍電鏡單顆粒技術(shù)對結構生物學(xué)發(fā)展的意義非凡，并將在未來(lái)學(xué)科的發(fā)展中繼續發(fā)揮巨大潛能。
02 師生互動(dòng)評論
圖1 Top Talk現場(chǎng)互動(dòng)交流丨圖片來(lái)源：劉鐘靈 、周珩拍攝
生命學(xué)院博士后周珩：“Frank教授做的核糖體可以解析出很多種構象的結構，但是我所做的機械力敏感的陽(yáng)離子通道Piezo2卻具有高度的柔性，通過(guò)三維分類(lèi)可以分出多種構象，但只有其中最穩定的構象可以解析到近原子分辨率。那么如何解析不穩定的中間構象的高分辨率結構呢？如果中間構象是由兩種成分的反應產(chǎn)生的，那么時(shí)間分辨的冷凍電鏡技術(shù)（Time-resolved cryo-EM）可以捕捉到這種中間構象，但是Piezo通道的中間構象是由施加機械力造成的，還有一些離子通道的中間構象是由膜電勢變化或者跨膜的電化學(xué)梯度引起的，這些中間構象就不能通過(guò)Time-resolved cryo-EM獲得其高分辨率結構。那么未來(lái)單顆粒冷凍電鏡能否解決這個(gè)問(wèn)題呢？”生命學(xué)院劉俊杰老師：“我建議需要針對蛋白的性質(zhì)做不同的處理，如果這種中間構象可以被特定的化學(xué)物質(zhì)所穩定，那么就需要添加這種化學(xué)物質(zhì)來(lái)使其穩定在這種構象，以解析結構；對第二個(gè)問(wèn)題，我認為T(mén)ime-resolved cryo-EM只是一個(gè)思路，確實(shí)它不能解析機械力、電勢變化和跨膜電化學(xué)梯度引起的中間構象，但是可以用類(lèi)似的思路設計專(zhuān)門(mén)針對這些離子通道的制樣裝置，用以解析其結構?！敝茜瘢骸坝绕溽槍缒る娀瘜W(xué)梯度引起的中間構象，可以通過(guò)將蛋白重組至脂質(zhì)體上，人為地控制脂質(zhì)體內外的電化學(xué)梯度，從而解析這類(lèi)特殊的蛋白的中間構象?！盕rank教授：“第一個(gè)問(wèn)題可采用Manifold embedding的方法，只要這種構象不是占比特別少，就可能通過(guò)這種方法解決，但是一般需要收集大量的數據?！敝茜瘢骸癕anifold embedding可以研究一種分子機器的多種構象間是以怎樣的能量路線(xiàn)發(fā)生變化的，的確可以用來(lái)研究中間構象，但是并不能通過(guò)這種方法直接獲取不穩定中間構象的高分辨率結構?！盕rank教授：“的確當前的方法無(wú)法解析這類(lèi)離子通道的開(kāi)放構象，可能需要具有工程學(xué)智慧的研究者開(kāi)發(fā)專(zhuān)門(mén)的制樣裝置以解析其結構。也許第一個(gè)開(kāi)發(fā)者就是你?！?/p>
圖2 王宏偉教授在Top Talk解答同學(xué)們的疑惑丨圖片來(lái)源：劉鐘靈 、周珩拍攝
生命學(xué)院博士生陳康凈：“關(guān)于單顆粒冷凍電鏡技術(shù)中結構異質(zhì)性，Frank教授發(fā)表過(guò)一種Manifold Embedding的方法，結合我自己的工作，在RSC-NCP復合物結構解析過(guò)程中，我們的密度中有一部分嘗試了很多計算上和生化上的方法都沒(méi)有解決。請問(wèn)Frank教授，Manifold EM方法的主要適用范圍如何，以及如何分析結構中的異質(zhì)性從而選擇合適的方法呢？”
Frank教授：“Manifold Embedding方法目前只在核糖體和RyR的結構解析中應用的比較好，對于其他大分子仍在研究?！?/p>
王宏偉老師：“其實(shí)很多中間構象并不重要，沒(méi)有太大生物學(xué)意義，我們只需要解析一些有重大生物學(xué)意義的結構即可。生物大分子的柔性目前也是結構生物學(xué)的難題，針對剪接體Manifold EM方法就不太適用?！?/p>
生命學(xué)院博士生徐家璐：“Frank教授談到冷凍電鏡分辨率革命正在發(fā)生；討論中王宏偉老師預計冷凍斷層成像子斷層平均法（sub-tomogram average）的近原子分辨率會(huì )比想象中地更快到來(lái)?！?/p>
生命學(xué)院博士生宋雨桐：“印象比較深刻的是王老師在討論中提出了一個(gè)非常大膽的設想，通過(guò)大幅改變電鏡設備，利用多電子束同時(shí)成像，快速獲取數據?！?/p>
王宏偉老師總結：“Frank的博士導師是Walter Hoppe，Frank質(zhì)疑自己導師的觀(guān)點(diǎn)，獨辟蹊徑開(kāi)發(fā)了單顆粒重構技術(shù)。但是Walter Hoppe也并沒(méi)有放棄自己的想法，他后來(lái)還有另一個(gè)學(xué)生叫Wolfgang Baumeister，繼續他的道路，經(jīng)過(guò)幾十年的研究，終于將這一技術(shù)也發(fā)展起來(lái)，成為電子顯微學(xué)另一主要分支cryo-ET領(lǐng)域的主要奠基人。我鼓勵大家在科研的道路上，大膽質(zhì)疑，堅持求索?！?/p>
巔峰對話(huà)TopTalk簡(jiǎn)介
清華大學(xué)“巔峰對話(huà)”（Toptalk）是由清華大學(xué)研究生會(huì )于2013年發(fā)起并主辦的多學(xué)科學(xué)術(shù)交流活動(dòng)。通過(guò)邀請以諾貝爾獎、圖靈獎、菲爾茲獎為主的各學(xué)科國際學(xué)術(shù)大師，為清華學(xué)生搭建與大師同臺對話(huà)的平臺，鼓勵清華學(xué)生質(zhì)疑學(xué)術(shù)權威、挑戰現有學(xué)術(shù)范式，培養同學(xué)們的批判性思維和創(chuàng )新能力，力求“對話(huà)激發(fā)創(chuàng )新”?！皫p峰對話(huà)”系列活動(dòng)已經(jīng)走過(guò)7個(gè)年頭，累計邀請到超過(guò)20位諾貝爾獎得主，7位圖靈獎得主，1位菲爾茲獎得主來(lái)到紫荊之巔。
本文經(jīng)授權轉載自微信公眾號“探臻科技評論”。本文系2020年10月26日第32期“Toptalk巔峰對話(huà)”實(shí)錄文稿。本文有刪改。
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