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突然襲來(lái)的新冠肺炎疫情讓人類(lèi)又一次見(jiàn)識了“病毒”的威力。
肉眼看不到的病毒作為一個(gè)物種，很可能從地球生命誕生之初就已經(jīng)存在，而人類(lèi)從意識到有病毒存在→看到病毒的模樣→弄清病毒的內部結構成分卻經(jīng)歷了漫長(cháng)的過(guò)程。病毒在19世紀末已被證實(shí)肯定存在，但因“阿貝極限”使光學(xué)顯微鏡無(wú)法達到更高的分辨率，始終看不到病毒的蹤影。
撰文 | 小溪
來(lái)源：中科院高能所
20世紀30年代，電子顯微鏡的發(fā)明使神秘的病毒終于現出了真身，只是電子顯微鏡的原理決定了它無(wú)法用于活細胞的觀(guān)察及獲取生物活動(dòng)的動(dòng)態(tài)信息，而攻克致病病毒，需要深入了解病毒在活細胞內感染、復制及釋放的動(dòng)態(tài)過(guò)程。
科學(xué)界期待著(zhù)能有可獲取生物過(guò)程動(dòng)態(tài)信息的、更高分辨率的光學(xué)顯微鏡。
光學(xué)顯微鏡的“阿貝極限”究竟有沒(méi)有可能被突破呢？
盡管每項科學(xué)技術(shù)的發(fā)展都會(huì )歷盡艱辛，只是沒(méi)想到，真正突破“阿貝極限”竟用了百余年，在此期間數項新技術(shù)的發(fā)明起到了極為關(guān)鍵的作用！
相 襯
“相襯”是顯微技術(shù)中的一個(gè)重大進(jìn)步。
光學(xué)顯微鏡觀(guān)察細胞時(shí)一般都需要染色，這是因為細胞結構中大部分組分都是透明的。透明度高的物體也稱(chēng)為位相物體，光波通過(guò)位相物體時(shí)不改變振幅 (光的強弱) 只改變位相，但人眼只能辨別出振幅的變化，因此在光學(xué)顯微鏡下難以區分不同的細胞組分。
用有機染料對不同的細胞組分進(jìn)行選擇性染色后，可借助不同的顏色反襯來(lái)提高細胞不同組分圖像的對比度，便于更清楚地進(jìn)行觀(guān)察和研究。但染色是一個(gè)非常困難和耗時(shí)的過(guò)程，常常會(huì )對觀(guān)察的生物樣本產(chǎn)生傷害，甚至殺死細胞。
波的位相示意圖
有沒(méi)有辦法讓光學(xué)顯微鏡的生物樣本可以不經(jīng)染色而直接清楚地觀(guān)察到活細胞的內部結構呢？
20世紀30年代初，荷蘭的弗里茨·澤尼克 (Frits Zernike) 在實(shí)驗中偶然發(fā)現：不可見(jiàn)的光相位變化可以轉變?yōu)榭梢?jiàn)的振幅變化，他根據位相理論研究出了位相反襯法 (一種光學(xué)信息處理方法) ，通過(guò)某種空間濾波器將位相變化產(chǎn)生的不可見(jiàn)信息轉化為與之等價(jià)的可見(jiàn)的振幅信息，改善透明物體成像的反襯度，可大大提高透明物體的可分辨性。
弗里茨·澤尼克(Frits Zernike)
澤尼克利用光的干涉原理，在傳統的光學(xué)顯微鏡中加入相位板 (將位相差轉換成振幅差) 研制出相襯顯微鏡 (Phase Contrast Microscope，簡(jiǎn)稱(chēng)PCM) 的原型機并申請了專(zhuān)利，可惜當時(shí)他的發(fā)明沒(méi)有受到重視。
第二次世界大戰的爆發(fā)影響了澤尼克的研究，但他以百折不撓的精神不斷改進(jìn)技術(shù)。1941年，第一臺實(shí)用的相襯顯微鏡終于在蔡司公司誕生。當時(shí)的顯微鏡觀(guān)察細胞時(shí)都需要染色(染色會(huì )殺死細胞) ，而相襯顯微鏡則可直接觀(guān)察到活細胞的內部結構。
目前，大部分高級光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡中都配置了相襯部件。相襯顯微鏡在細菌學(xué)、病理學(xué)等方面應用廣泛，生物學(xué)研究因此有了極大突破(澤尼克因論證相襯法及發(fā)明相襯顯微鏡的貢獻獲1953年諾貝爾物理學(xué)獎)。
早期的相襯顯微鏡
下排是透明樣品加上相襯技術(shù)后的顯微圖像
熒 光
熒光的發(fā)現為后來(lái)超分辨率光學(xué)顯微鏡的研制打下了基礎。
早在1845年，英國皇家學(xué)會(huì )的約翰·赫歇爾 (John Herschel) 在一份報告中描述了他觀(guān)察到的一種現象：加了硫酸奎寧 (一種藥物) 的蘇打水在太陽(yáng)光照射下會(huì )發(fā)出天藍色的光。以后，雖然也有人發(fā)現類(lèi)似的現象，但一直沒(méi)人能給出科學(xué)的解釋。
約翰·赫歇爾(John Herschel)
1852年，英國的喬治·斯托克斯 (George Stokes) 在他的巨著(zhù)《論光的折射率變化 (On the Change of Refrangibility of Light) 》中指出：用分光計觀(guān)察太陽(yáng)光照射奎寧和葉綠素的水溶液時(shí)，只有當溶液置于光譜的紫外光區域才會(huì )產(chǎn)生所發(fā)光的波長(cháng)比入射光波長(cháng)要長(cháng)效果。
斯托克斯判定：這種現象是由于這些物質(zhì)吸收光能后重新發(fā)射出不同波長(cháng)的光 (屬光致發(fā)光)，并非因光的漫射作用引起，他把這種光稱(chēng)為熒光 (Fluorescence)。
1864年他在一次演講中首次提出：熒光可作為一種分析工具，可惜他的建議沒(méi)能被很快地應用于光學(xué)顯微成像技術(shù)。
喬治·斯托克斯(George Stokes)
過(guò)了40多年，德國的奧古斯特·科勒 (August K?hler) 與亨利·西登托普夫 (Henry Siedentopf) 于1911年研制出首個(gè)熒光顯微鏡 (Fluorescence Microscope) 測試裝置。
當時(shí)的熒光顯微鏡以紫外光線(xiàn)為光源，用熒光色素對觀(guān)測目標 (細菌、植物、動(dòng)物組織等)進(jìn)行染色處理，紫外光的照射會(huì )激發(fā)觀(guān)測目標上的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，研究者根據自發(fā)熒光的成像開(kāi)展研究。
熒光顯微鏡可用于觀(guān)察細菌、植物和動(dòng)物組織中的自發(fā)熒光現象。但因植物和動(dòng)物組織中的自發(fā)熒光很弱，加之當時(shí)相關(guān)的技術(shù)還不夠成熟，熒光顯微鏡的應用在20世紀初期發(fā)展較慢。
奧古斯特·科勒(August K?hler)、亨利·西登托普夫(Henry Siedentopf)
第一臺熒光顯微鏡測試裝置
20世紀30年代后，得益于各相關(guān)科學(xué)領(lǐng)域技術(shù)的進(jìn)步和創(chuàng )新，熒光顯微成像技術(shù)迎來(lái)了新的發(fā)展機遇。
1935年，奧地利的馬克斯·海廷格 (Max Haitinger) 等人改進(jìn)了生物組織標本的染色技術(shù)，用熒光色素染色來(lái)標記不能自發(fā)熒光的特定組織成分、細菌和其它病原體，標本的熒光亮度增強了，在熒光顯微鏡下可觀(guān)察到生物組織的續發(fā)性熒光。20世紀50年代，隨著(zhù)熒光抗體標記方法及熒光顯微鏡裝置的改進(jìn)，熒光技術(shù)的應用逐漸推廣。
日本的下村修 (Osamu Shimomura) 等人1962年從維多利亞水母中發(fā)現了一種奇特的蛋白質(zhì)，從藍光到紫外線(xiàn)都能使其受激發(fā)而發(fā)出綠色熒光。1974年，他們得到了這種蛋白的純化物，稱(chēng)為綠色熒光蛋白 (Green Fluorescent Protein，簡(jiǎn)稱(chēng)GFP) 。綠色熒光蛋白的最突出特點(diǎn)是光毒性比傳統的熒光分子弱得多，非常適合用于對活細胞進(jìn)行標記。而基于綠色熒光蛋白的光學(xué)成像技術(shù)可使觀(guān)察者直接看到從微觀(guān)到宏觀(guān)各個(gè)層次的生命現象。
下村修(Osamu Shimomura)
在發(fā)現綠色熒光蛋白20多年后，美國的馬丁·查爾菲 (Martin Chalfie) 于1993年通過(guò)基因重組技術(shù)使除水母以外的生物 (大腸桿菌等) 也產(chǎn)生出綠色熒光蛋白。他將綠色熒光蛋白真正應用于生物樣品的標記，建立起用綠色熒光蛋白研究基因表達的基本方法。由于許多重大疾病都與基因表達異常相關(guān)，查爾菲的成果意義重大。
美籍華人錢(qián)永健 (Roger Y. Tsien) 大幅度改造優(yōu)化了綠色熒光蛋白，提升了它的發(fā)光效率，還進(jìn)一步發(fā)展出紅、藍、黃色的熒光蛋白，在生物學(xué)研究領(lǐng)域得到了廣泛應用。這些熒光蛋白成為生物學(xué)家們得心應手的工具，實(shí)時(shí)監測各類(lèi)病毒“作案”過(guò)程的愿望已可以實(shí)現了。
下村修、查爾菲與錢(qián)永健三位科學(xué)家因發(fā)現、提取和改進(jìn)綠色熒光蛋白的杰出貢獻獲得了2008年諾貝爾化學(xué)獎。
馬丁·查爾菲(Martin Chalfie)
錢(qián)永健(Roger Y. Tsien)
熒光顯微鏡
熒光標記的重組病毒感染模型系統
激 光
“強光源”也是迫切需要解決的關(guān)鍵技術(shù)！
阿爾伯特·愛(ài)因斯坦 (Albert Einstein) 1916年提出了“關(guān)于輻射的量子理論 (On the Quantum Theory of Radiation) ”，其中包括“受激輻射的光放大 (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation，簡(jiǎn)稱(chēng)Laser) ”的概念 (中文譯為激光)，這是如何得到強光源的一個(gè)思路，他的論述為后來(lái)激光的實(shí)現奠定了理論基礎。
但在自然界普通光源中，產(chǎn)生受激輻射的成分很少，當時(shí)的人們并沒(méi)認識到該理論的實(shí)際應用價(jià)值。
阿爾伯特·愛(ài)因斯坦(Albert Einstein)(左)，他1916年發(fā)表的論文(右)
基于愛(ài)因斯坦的理論，幾十年之后的1953年，美國的查爾斯·唐尼斯 (Charles Townes) 研制成功一臺受激輻射微波放大裝置。后來(lái)該項技術(shù)由微波擴展到紅外及可見(jiàn)光范圍。
1958年，唐尼斯與亞瑟·肖洛(Arthur Schawlow)在《物理評論(Physical Review)》雜志上發(fā)表論文，闡述了研制激光器的可能性以及所需的條件，指出這種激光具有亮度極高、單色性好、方向性好的特點(diǎn)。
就在同一時(shí)期，蘇聯(lián)的亞歷山大·普羅霍洛夫 (Aleksandr Prokhorov) 及尼古拉·巴索夫(Nicolay Basov) 也提出了類(lèi)似的設想。他們的設想非常吸引人，許多國家竟相開(kāi)始研制激光器，各種實(shí)驗方案都有，只是都未獲得成功。
這幾位都是了不起的人物，赫赫有名的科學(xué)大伽，愛(ài)因斯坦就不用說(shuō)了。而唐尼斯、普羅霍洛夫及巴索夫三人分享了1964年諾貝爾物理學(xué)獎，肖洛則獲得了1981年諾貝爾物理學(xué)獎。
亞瑟·肖洛(Arthur Schawlow)、查爾斯·唐尼斯(Charles Townes)
亞歷山大·普羅霍洛夫(Aleksandr Prokhorov)、尼古拉·巴索夫(Nicolay Basov)
真正研制出第一臺激光器的是美國加利福尼亞州休斯航空公司實(shí)驗室的西奧多·梅曼(Theodore Maiman)。1960年5月16日，梅曼在自己研制的紅寶石激光器上成功獲得了波長(cháng)為694.3納米的激光。7月7日，休斯公司正式宣布了這個(gè)消息。此后，不同工作物質(zhì)的激光器陸續研制出來(lái)，如氦氖氣體激光器、二氧化碳激光器等，激光在各領(lǐng)域的應用研究也迅速展開(kāi)。
激光的亮度可比普通光源高20個(gè)量級，而且是在包括紅外?可見(jiàn)光?紫外直至X射線(xiàn)波段內的相干輻射光源，意義極為重大，因此被譽(yù)為是20世紀繼原子能、計算機、半導體之后的又一重大發(fā)明。梅曼獲得富蘭克林學(xué)會(huì )、美國物理學(xué)會(huì )、光學(xué)學(xué)會(huì )等多個(gè)獎項，曾兩度被諾貝爾獎提名，可惜未能獲得諾貝爾獎。
西奧多·梅曼(Theodore Maiman)與他研制的紅寶石激光器
共聚焦
激光技術(shù)的突破使另一關(guān)鍵技術(shù)——“共聚焦成像”的構想有了成功的可能。
共聚焦成像 (Confocal Imaging) ”的構想是美國的馬文·明斯基 (Marvin Minsky)(被稱(chēng)為“人工智能之父”) 在20世紀50年代提出的。
其原理是利用逐點(diǎn)掃描照明，并用空間針孔濾波手段去除樣品焦點(diǎn)平面外散射光進(jìn)行共聚焦成像。他為此設想申請了專(zhuān)利，也研制出一臺共聚焦掃描顯微鏡的樣機。
但當時(shí)缺乏適用的超強光源，加之數據處理能力也還達不到所需的標準，這個(gè)構想實(shí)際上只停留在理論階段。
馬文·明斯基(Marvin Minsky)
明斯基研制的共聚焦掃描顯微鏡樣機
梅曼的激光器研制獲得成功之后，美國的保羅·達維多維茨 (Paul Davidovits) 和大衛·埃格爾 (David Egger) 于1969年以氦氖激光器為激發(fā)光源，制成了一臺激光掃描顯微鏡原型機。
1978年，德國的托馬斯·克里默 (Thomas Cremer) 和克里斯托夫·克里默(Christoph Cremer)兄弟首次提出了共聚焦激光掃描顯微鏡 (Confocal Laser Scanning Microscope，簡(jiǎn)稱(chēng)CLSM) 的設計方案：在熒光顯微鏡成像的基礎上加裝激光掃描裝置，用激光聚焦逐點(diǎn)掃描方式結合熒光標記生物樣品的三維探測方法，通過(guò)計算機處理手段重構生成三維圖像(與掃描電子顯微鏡類(lèi)似)。
真正商業(yè)化的共聚焦激光掃描顯微鏡于1987年問(wèn)世。
克里斯托夫·克里默(Christoph Cremer)、托馬斯·克里默(Thomas Cremer)
共聚焦激光掃描顯微鏡
從理論上說(shuō)，該項技術(shù)的光學(xué)成像空間分辨能力并未真正突破“阿貝極限”，但其所得的物像分辨率比傳統的光學(xué)成像提高了30%~40%，大大優(yōu)化了成像質(zhì)量。
共聚焦激光掃描顯微鏡現已成為使用廣泛的高分辨率三維光學(xué)成像工具，通過(guò)移動(dòng)透鏡系統對半透明物體進(jìn)行三維掃描，在計算機系統的輔助下，對樣品從外觀(guān)到內在、從靜態(tài)到動(dòng)態(tài)、從形態(tài)到功能進(jìn)行全方位的觀(guān)察。
真正突破
對“阿貝極限”的真正挑戰要從20世紀90年代說(shuō)起。
1994年，德國的斯蒂芬·黑爾 (Stefan Hell) 提出了受激發(fā)射損耗 (STimulated Emission Depletion，簡(jiǎn)稱(chēng)STED) 技術(shù)，用以突破“阿貝極限”實(shí)現超高分辨率成像。所謂“阿貝極限”，是光學(xué)元件的衍射效應造成的。
光學(xué)顯微鏡的照明光經(jīng)光學(xué)系統聚焦后在樣品上形成的光斑實(shí)際上是個(gè)光的衍射斑，在此斑范圍內的樣品會(huì )發(fā)出照明光引發(fā)的熒光，使這部分樣品的細節信息無(wú)法被分辨。要實(shí)現超越“阿貝極限”，關(guān)鍵是設法減少單個(gè)掃描點(diǎn)處的有效熒光發(fā)光面積。
黑爾提出的方法十分巧妙，他設想同時(shí)使用兩束激光來(lái)照射樣品，一束為激發(fā)光，另外一束為空心形的受激發(fā)射損耗光，樣品上發(fā)生受激發(fā)射損耗效應的部分不能發(fā)出熒光，僅樣品的中心區域可發(fā)出輻射熒光，這樣就可達到大大降低熒光激發(fā)半徑的目的。
可以想象，實(shí)現這項技術(shù)的難度相當大，黑爾于2000年終于用兩臺鈦寶石飛秒脈沖激光器實(shí)現了超高分辨率受激發(fā)射損耗顯微成像。
斯蒂芬·黑爾(Stefan Hell)
除了受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)，還有幾項重要的技術(shù)獲得了突破。
美國的埃里克·白茲格 (Eric Betzig) 與威廉·莫爾納 (William Moerner) 分別獨立發(fā)現了單分子開(kāi)關(guān)的方法，利用圖像多次疊加的技術(shù)得到單分子的精確定位，再將這些分子的熒光圖像合成，可獲得比傳統光學(xué)顯微鏡至少高10倍以上的分辨率。
白茲格將該項技術(shù)稱(chēng)為光激活定位顯微術(shù) (Photo Activated Localization Microscopy，簡(jiǎn)稱(chēng)PALM)。
埃里克·白茲格(Eric Betzig)
威廉·莫爾納(William Moerner)
美國哈佛大學(xué)的華裔女科學(xué)家莊小威 (Xiaowei Zhuang) 等人發(fā)明了利用有機染料 (不用熒光蛋白) 對熒光分子的可調控性對單分子進(jìn)行精確定位，再用圖片重組方式獲得超高分辨率顯微鏡圖像的技術(shù)——隨機光學(xué)重建顯微術(shù) (STochastic Optical Reconstruction Microscopy，簡(jiǎn)稱(chēng)STORM) 。
莊小威積極推動(dòng)了這項技術(shù)的發(fā)展，既實(shí)現了三維同時(shí)超分辨率顯現，又進(jìn)一步提高了該技術(shù)的成像速率 (莊小威的成果與埃里克·白茲格的成果在2006年同時(shí)發(fā)表，只是莊小威投稿的日期晚了4個(gè)月)。
莊小威(Xiaowei Zhuang)
正是由于上述多項技術(shù)的創(chuàng )新，光學(xué)顯微鏡最終實(shí)現了“阿貝極限”的真正突破 (分辨率達20納米)，使能進(jìn)行活體物質(zhì)觀(guān)察的光學(xué)顯微鏡又重新煥發(fā)出青春，這對多個(gè)前沿研究領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響，尤其是為常溫下活體生物學(xué)研究帶來(lái)了重大機遇。
生物學(xué)家們能夠實(shí)時(shí)觀(guān)察到生物分子如何在大腦神經(jīng)細胞之間生成神經(jīng)突觸，看到病毒顆粒侵入細胞的全過(guò)程，甚至還可追蹤帕金森、阿爾茲海默癥、亨廷頓癥患者體內相關(guān)蛋白的累積過(guò)程 (莫爾納、黑爾、白茲格三人被授予2014年諾貝爾化學(xué)獎(很遺憾莊小威未能獲獎))。
突破“阿貝極限”的光學(xué)顯微鏡
受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)(左)與一般光學(xué)顯微鏡圖像(右)的對比
共聚焦顯微鏡(CLSM)(左)與受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)圖像(右)的對比
難能可貴的是，黑爾在獲諾貝爾獎之后給自己制定了進(jìn)一步提高分辨率的奮斗目標——被他稱(chēng)為“后諾獎超分辨率”。
2017年初，他的團隊在Science發(fā)表了題為“Science-2017-Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes”的論文，介紹了結合了STED、PLAM和STORM技術(shù)優(yōu)勢的MINFLUX超分辨率熒光顯微鏡 (也稱(chēng)為納米顯微鏡) 。研究團隊的實(shí)驗實(shí)現了6納米的分辨率，他們的目標是實(shí)現1納米的分辨率，使生物學(xué)家不僅可看清病毒的結構，還可清晰地觀(guān)察病毒感染細胞的整個(gè)過(guò)程，最終找到滅殺病毒的有效方法。
斯蒂芬·黑爾(Stefan Hell)和他的MINFLUX研究團隊
共聚焦顯微鏡圖像(上左)、受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)圖像(上右)、超分辨率熒光顯微鏡(MINFLUX)圖像(下)的對比
據最新報道，黑爾的MINFLUX團隊又取得了新進(jìn)展，實(shí)現了細胞中3D多色、優(yōu)于1納米分辨率的成像，題為“MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells”的論文2020年1月13日發(fā)表在Nature Methods。
黑爾MINFLUX研究團隊取得的最新進(jìn)展
雙色3D MINFLUX納米顯微鏡圖像顯示的細胞分布及蛋白質(zhì)距離(上圖)，傳統顯微鏡圖像(下圖左)
生命體與成像設備分辨率的對應關(guān)系示意圖
結 語(yǔ)
“阿貝極限”是恩斯特·阿貝 (Ernst Abbe) 1873年提出的。根據阿貝的理論，光的基本衍射性質(zhì)決定了以可見(jiàn)光 (波長(cháng)范圍在0.38~0.78微米) 作為光源的光學(xué)顯微鏡無(wú)法實(shí)現0.2微米(約可見(jiàn)光波長(cháng)的二分之一) 以下的分辨率。
在一代又一代科學(xué)家堅持不懈的努力之下，百余年之后的21世紀初，光學(xué)顯微鏡終于實(shí)現了“阿貝極限”的真正突破！超高分辨率的光學(xué)顯微鏡使科學(xué)家們能深入了解病毒在活細胞內感染、復制及釋放的整個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，為人類(lèi)攻克致病病毒提供了有力的工具。
“阿貝極限”的真正突破經(jīng)歷了百余年，衷心地向為此做出杰出貢獻的科學(xué)家們表示深深的敬意！
本文經(jīng)授權轉載自微信公眾號“中科院高能所”，圖片源自網(wǎng)絡(luò )。
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