国产高清手机看片偷拍在线_ 基礎免疫學(xué)發(fā)現到腫瘤免疫治療的轉化之旅

近年來(lái)腫瘤免疫治療發(fā)展如此迅猛，當然離不開(kāi)近50年免疫學(xué)基礎和相關(guān)技術(shù)進(jìn)步，這些進(jìn)步使檢驗點(diǎn)抑制和T細胞修飾成為可能。在此，我們將重溫并談?wù)撘恍┩苿?dòng)腫瘤免疫治療發(fā)展的重要研究成果。其中，胸腺功能、T細胞和免疫監視機制的發(fā)現都是如今靶向免疫治療和嵌合受體發(fā)展的基石。

機體的免疫系統是我們防御感染以及其它外源物質(zhì)（移植物和腫瘤）的保護系統，維持著(zhù)我們的完整性。免疫學(xué)和腫瘤學(xué)之間源遠流長(cháng)的關(guān)系，屬于生物醫學(xué)范疇。在過(guò)去50年里，兩者不斷相互交叉發(fā)展。在此，我們重數在T細胞的發(fā)現至腫瘤免疫治療應用史上的重要事跡。對小鼠白血病的經(jīng)典研究是后期胸腺淋巴細胞發(fā)現、成熟和分類(lèi)的根基。接下來(lái)的一序列研究引出了免疫監視理論，另外免疫編輯學(xué)說(shuō)讓人們重新認識到免疫系統在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的雙重作用。隨著(zhù)對抗原識別、T細胞激活和共刺激分子信號的認識，科學(xué)家們漸漸開(kāi)始嘗試將這些知識轉化應用到腫瘤治療中。腫瘤浸潤T細胞（Tumor infiltrating T cells）也被用于對一些黑色素瘤患者的過(guò)繼細胞治療（ACT, Adoptive cell transfer）中。緊接著(zhù)腫瘤疫苗也被研發(fā)出，用于增強患者本身的抗腫瘤免疫反應。近來(lái)熱門(mén)的兩種治療方式都是通過(guò)改造共刺激信號調控T細胞活性發(fā)展而來(lái)。一種是采用單克隆抗體技術(shù)，通過(guò)檢驗點(diǎn)抑制或Treg細胞祛除對共刺激信號分子CTLA-4、PD-1進(jìn)行抑制，從而使腫瘤浸潤T細胞從中解脫。另一種是采用轉基因技術(shù)，使患者T細胞重新靶向腫瘤抗原并增強T細胞活性，從而克服腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境形成的腫瘤免疫障礙。這兩種技術(shù)被《科學(xué)》雜志評為2013年度技術(shù)突破，CTLA-4抗體Ipillimumab于2011年獲得FDA批準，CD19-CAR也于2014年被授權用于A(yíng)LL（Acute lymphoblastic leukemia）的臨床治療。本文將重溫在腫瘤免疫治療發(fā)展史中重要的基礎研究成果。

白血病引發(fā)的免疫學(xué)“血案”

1960年以前，胸腺一直被認為是進(jìn)化過(guò)程中殘留的多余器官，僅僅是淋巴細胞的墳墓。直至1962年，Gowans等人發(fā)現再循環(huán)的淋巴細胞依然具有正常細胞免疫反應或體液免疫反應的能力，但胸腺淋巴細胞被認為不具有上述免疫能力，因為不進(jìn)行再循環(huán)，因此也無(wú)法將免疫反應傳輸至適當的受體。再者，胸腺切除也未給成年動(dòng)物免疫能力帶來(lái)不利影響。盡管如此，1959-1961期間，由于發(fā)現Gross白血病毒會(huì )引起小鼠發(fā)生淋巴細胞白血病，因此很多實(shí)驗用的是切除了胸腺的新生小鼠。

為了在不容易患白血病的小鼠上研究白血病，小鼠在一出生就接種Gross病毒。接種病毒1月后進(jìn)行胸腺切除可以有效防止白血病的發(fā)生，接種病毒的小鼠成年后，胸腺切除6月后再移植新生小鼠胸腺依然能患白血病。這試驗清晰的說(shuō)明，病毒一直潛伏在小鼠的非白血病相關(guān)的胸腺組織中，因為切除了胸腺。

因此有人猜想，誘發(fā)不容易患白血病的小鼠患白血病的話(huà)，病毒必須在小鼠剛出生時(shí)接種，因為病毒要在僅存于新生胸腺中的一些細胞中進(jìn)行復制。為了驗證這一猜想，小鼠一出生就進(jìn)行了胸腺切除，之后立馬接種病毒。這些切除了胸腺的小鼠斷奶后幾周內還是好好的，可后來(lái)非常消瘦，病的病，死的死。這個(gè)現象在成年小鼠胸腺切除后不會(huì )發(fā)生。

解剖發(fā)現這些小鼠肝臟由于感染HBV病毒嚴重受損，血液和淋巴組織中的淋巴細胞非常少。淋巴細胞在移植物排斥和其它一些免疫反應中發(fā)揮作用，因此切除胸腺的新生小鼠在出現斷奶后消瘦之前用來(lái)研究對外源皮膚移植物的免疫反應。結果發(fā)現，它們對外源皮膚移植物沒(méi)有產(chǎn)生免疫排斥反應，盡管供體與受體之間存在顯著(zhù)的MHC-H2差異，上述小鼠對一些特定的抗原綿羊紅細胞和傷寒沙門(mén)菌H等之類(lèi)的也無(wú)法產(chǎn)生正常的體液抗體反應。

胸腺移植能恢復免疫反應，但是對胸腺供體種屬來(lái)源的皮膚移植物依然不排斥。這說(shuō)明免疫耐受可能來(lái)源于胸腺：抗原物質(zhì)與胸腺分化而來(lái)的一些細胞接觸后通過(guò)某些機制抑制這些細胞成熟，因此無(wú)法正常免疫反應。該負選擇假說(shuō)在后期被超級抗原和轉基因小鼠技術(shù)證實(shí)，同時(shí)揭示出胸腺細胞的正負雙選擇機制。胸腺細胞分化方面的事件綜述近期已有發(fā)表。

關(guān)于胸腺是否通過(guò)播種細胞至其它淋巴系統來(lái)執行功能的，這一點(diǎn)很重要。在那時(shí)還沒(méi)有鑒定不同來(lái)源細胞的標記，因此選用T6品種小鼠，因為它的細胞由于在M期會(huì )出現兩分染色體而被鑒定出。F1代小鼠雙親都在剛出生時(shí)進(jìn)行了胸腺切除，其中一只是T6品種小鼠，兩只小鼠均移植來(lái)源于另一F1代品系小鼠的胸腺并用不同品種供體來(lái)源的外源皮膚進(jìn)行免疫刺激。根據M期細胞的染色體組成分析發(fā)現脾臟中約15-20%的細胞來(lái)源于移植的胸腺。這一現象證實(shí)了胸腺確實(shí)產(chǎn)生了遷移的細胞，這些細胞在遷移之前成熟或者在遷移至外周淋巴細胞庫中成熟從而具有免疫功能。

盡管成年小鼠進(jìn)行胸腺切除對其免疫能力沒(méi)有什么影響，但對小鼠本身肯定會(huì )帶來(lái)一些問(wèn)題，畢竟淋巴系統遭到如同全身照射后的破壞。小鼠進(jìn)行局部照射或全身照射時(shí)骨髓對小鼠（ATxBM）具有保護功能就是這種情況。這一模型對于后期免疫功能研究來(lái)說(shuō)非常有用。

所有的這些成果起初或多或少都受人批評懷疑。模棱兩可的批評更比比皆是，有人質(zhì)疑說(shuō)：小鼠的情況比較特殊，這些結果不能說(shuō)明人體中的問(wèn)題。這確實(shí)值得驗證，用于試驗的小鼠畢竟是關(guān)在普通籠子里的，新生胸腺切除帶來(lái)的損傷使它們非常容易受感染。但當把試驗小鼠在無(wú)菌環(huán)境飼養下并進(jìn)行試驗后，這種質(zhì)疑的聲音馬上就被平息，因此這種小鼠在進(jìn)行新生胸腺切除后并未出現異常消瘦，而且也還是無(wú)法對異源皮膚移植物產(chǎn)生排斥反應，盡管具有MHC-H-2差異。1968年，裸鼠問(wèn)世，免疫學(xué)家們從此也不再懷疑胸腺的免疫功能了。

胸腺先天萎縮的Di George綜合征兒童患者，進(jìn)行胸腺移植后能重獲免疫力。但主要的問(wèn)題在于組織兼容性和供體來(lái)源。近期通過(guò)人工高表達Foxn1基因將小鼠胚胎成纖維細胞重編程至新生胸腺上皮細胞的重要研究成果又為胸腺組織制備邁出成功的第一步。

小鼠T細胞和B細胞的鑒定

如前所述，Gowans報道稱(chēng)再循環(huán)的淋巴細胞能產(chǎn)生細胞免疫反應和分泌抗體的體液免疫反應。Gowans還猜想這些細胞亦或者也參與了抗原刺激免疫反應過(guò)程。因為新生胸腺切除后的小鼠既不能產(chǎn)生細胞免疫反應，也不能產(chǎn)生一些體液免疫反應，因此迫切需要證實(shí)新生胸腺切除小鼠不但缺少血液淋巴細胞，同時(shí)還缺少再循環(huán)淋巴細胞。后來(lái)科學(xué)家通過(guò)對新生胸腺切除小鼠和照射小鼠模型插入胸管進(jìn)行24-48小時(shí)時(shí)間段的淋巴收集。得出結論稱(chēng)絕大部分收集到的淋巴細胞（TDL）都來(lái)源于胸腺組織，并在后期試驗中得到證實(shí)。

那這些細胞是否也參與抗體產(chǎn)生和排斥反應呢？下面兩個(gè)試驗表明，答案有可能為否。Claman發(fā)現照射小鼠進(jìn)行同源骨髓和胸腺細胞雙重移植比單移植骨髓或胸腺細胞能產(chǎn)生更多的抗體。那時(shí)還沒(méi)有抗體標記，因此產(chǎn)生抗體的細胞的來(lái)源很難鑒定。但Burnet實(shí)驗室用鳥(niǎo)類(lèi)進(jìn)行上述試驗得出不一致的結論，注射睪丸素對其法氏囊進(jìn)行破壞后，試驗鳥(niǎo)類(lèi)無(wú)法產(chǎn)生抗體，胸腺的萎縮也使得試驗鳥(niǎo)類(lèi)無(wú)法產(chǎn)生排斥反應。Burnet就上述現象解釋道：哺乳動(dòng)物沒(méi)有法氏囊，在哺乳動(dòng)物中，胸腺有可能也行使著(zhù)鳥(niǎo)類(lèi)法氏囊的功能，即將能產(chǎn)生抗體的細胞運輸至機體。

1967年和1968年，Miller和Mitchell采用CBA小鼠骨髓和胸管淋巴細胞（TDL）對新生胸腺切除的CBA照射小鼠進(jìn)行胸腺重建試驗，并用綿羊紅細胞進(jìn)行免疫刺激。結果發(fā)現試驗中的ATxBM小鼠接受了TDL細胞注射后，能產(chǎn)生抗體分泌細胞并裂解綿羊紅細胞。當綿羊紅細胞和脾臟細胞進(jìn)行共培養斑點(diǎn)試驗時(shí)證實(shí)了上述現象。接下來(lái)就是證實(shí)TDL細胞是不是能產(chǎn)生抗體分泌細胞的時(shí)候。簡(jiǎn)單的將抗CBA品系小鼠抗原（致敏C57BL小鼠而來(lái)）的血清與CBA小鼠組織加至平板中或抗C57BL品系小鼠抗原（致敏CBA小鼠而來(lái)）的血清與C57BL加至平板中觀(guān)察反應就能解開(kāi)上述疑問(wèn)。后者應該殺傷一切CBA與C57BL雜交子代小鼠 TDL來(lái)源（即胸腺來(lái)源）的抗體分泌細胞（圖1）。試驗結果異常振奮人心，毫無(wú)疑問(wèn)的證實(shí)了抗體分泌細胞并非來(lái)源TDL細胞而是來(lái)源骨髓。因此淋巴細胞也可以分為兩類(lèi)，一類(lèi)胸腺來(lái)源的T細胞，不產(chǎn)生抗體，但對另一類(lèi)B淋巴細胞從骨髓分化形成、產(chǎn)生抗原特異性抗體非常重要。同時(shí)也具有協(xié)助骨髓源性淋巴細胞產(chǎn)生抗體。因此，鳥(niǎo)類(lèi)法氏囊相當于哺乳動(dòng)物的骨髓。

圖1. 圖解T細胞和B細胞分別來(lái)源于胸腺和骨髓

將淋巴細胞分為上述兩類(lèi)起初也遭到一些反對。在1968年舉辦的一次Brook Lodge會(huì )議上，Good聲稱(chēng)不能將胸腺源性細胞和骨髓源性細胞分開(kāi)，因為胸腺源性細胞本身就來(lái)源于骨髓，他還說(shuō)自己有證據能證明在兔子中，骨髓存在于髂淋巴組織和闌尾淋巴組織中。大會(huì )上，證實(shí)了再循環(huán)淋巴細胞免疫功能的Gowans說(shuō)：“要不是Miller的試驗，我可能會(huì )假設在我們所有的試驗中都只存在一種淋巴細胞，但居然我們有兩種淋巴細胞甚至相互協(xié)同作用，那我們就應當對其進(jìn)行特性分類(lèi)，一種胸腺源性淋巴細胞，另一種骨髓源性的淋巴細胞。問(wèn)題就在于如何將兩種細胞聯(lián)合起來(lái)。聯(lián)合會(huì )給相互之間帶來(lái)什么問(wèn)題？隨機組合似乎解決不了問(wèn)題?！苯酉聛?lái)來(lái)自澳大利亞國立大學(xué)免疫學(xué)教授提出更簡(jiǎn)短的諷刺性批評，T細胞和B細胞那就是“bullshit”的起始字母。

上述的一些簡(jiǎn)單試驗，雖沒(méi)有采用現代技術(shù)基因打靶、CD抗原分類(lèi)、單抗和流式檢測等，但依然改變并推動(dòng)了免疫學(xué)的發(fā)展。要證實(shí)T細胞和B細胞的存在，就需要重復一序列的免疫學(xué)現象試驗，包括免疫傳遞效應、免疫耐受、記憶性免疫、免疫缺陷、自身免疫和免疫反應中T細胞和B細胞的功能。后期還需要進(jìn)行一序列試驗對淋巴細胞進(jìn)行亞類(lèi)分群和功能鑒定。

抗原識別受體是B淋巴細胞的Ig分子，但也有人反對稱(chēng)T細胞受體也能識別抗原。一些學(xué)者強烈聲明說(shuō)存在另一種Ig分子IgT。盡管如此，其他一些學(xué)者證實(shí)出T細胞的Ig分子來(lái)源于B細胞，與T細胞Fc受體結合上去的，Ig分子VH表達序列的RNA分子在T細胞中無(wú)法檢測到。單抗的發(fā)現最終導致TCR結構的闡明，很快人源和鼠源單抗的編碼序列就被克隆出。TCR鏈（α和β或γ和δ）和Ig分子高度同源，并且與T細胞膜上的CD3相互作用，形成由多肽鏈γ、ε、δ和二硫鍵連接的ζ-ζ同源二聚體或ζ-η異源二聚體組成的復合物。這些復合物不但調控TCR的表達與組裝，還負責抗原結合后的信號傳遞。TCR能介導轉基因小鼠的抗原特異性為20年后以TCR為基礎的T細胞修飾做好鋪墊。

既然T細胞和B細胞采用不同的抗原特異性受體，那與抗原結合機制是不是也不同呢？確實(shí)如此，B細胞能識別可溶性抗原，T細胞一般識別抗原遞呈細胞（APC）或病毒感染的細胞表面的抗原分子。小鼠體內感染病毒后的細胞毒性T細胞分離出來(lái)在體外進(jìn)行殺傷試驗發(fā)現，T細胞只對和T細胞來(lái)源種屬一樣MHC分子分型的靶細胞有作用。這說(shuō)明，在病毒產(chǎn)物和細胞表面MHC分子之間存在一種連接，TCR的特異性同時(shí)與MHC分子和病毒產(chǎn)物相關(guān)。這種現象后面被定義為MHC限制作用，MHC分子是限制作用的重要元素。T細胞實(shí)際只識別嵌入MHC分子的小段肽段。T細胞和B細胞對抗原的處理與腫瘤免疫和腫瘤細胞免疫逃逸密切相關(guān)。腫瘤細胞基因組不穩定從而突變導致細胞表面抗原或MHC分子的缺失因此能防止T細胞和B細胞的免疫反應。CARs有效的將兩種免疫反應模式和Ig VH基因的優(yōu)勢應用至T細胞中。

后來(lái)T細胞亞群和功能也被鑒定出來(lái)，包括CD4、CD8 T細胞、NKT細胞和CD4+CD25+FoxP3+表型的Treg細胞。自身免疫耐受，如前所述，主要是通過(guò)胸腺中自身反應的胸腺細胞負選擇實(shí)現。盡管如此，有些自身免疫的T細胞（與自身抗原低親和的T細胞）逃至外周，在外周中也有通過(guò)Treg細胞功能的防止自身免疫的耐受機制。Treg細胞要么由T細胞發(fā)育過(guò)程產(chǎn)生，要么經(jīng)初始CD4+ T細胞誘導分化形成（稱(chēng)為iTreg），并表達轉錄因子Foxp3標記物。這些細胞通過(guò)高親和力的IL-2三聚體受體大量吸收IL-2，從而使得其它T細胞缺失IL-2生長(cháng)因子，但腫瘤微環(huán)境中的Treg細胞抑制其它T細胞摧毀腫瘤細胞的具體機制尚不完全清晰。有可能與TGFβ、IL-10、IL-35等抑制性因子的產(chǎn)生有關(guān)。

本文的目的不在于對T細胞和B細胞發(fā)展史中重要研究成果的具體描述，相關(guān)綜述已有發(fā)表。但值得一提的是，有些T細胞發(fā)育或功能調控基因正用于免疫缺陷疾病的治療，包括編碼IL受體通用的γ鏈基因、編碼Wiskott-Aldrich綜合癥蛋白的基因等等。

免疫監視至腫瘤疫苗和過(guò)繼T細胞療法

研究揭示新生胸腺切除小鼠比正常小鼠對致癌物質(zhì)（比如3,4-苯并芘）和多瘤病毒更敏感，這為后期Paul Ehrlich的免疫監視學(xué)說(shuō)提供了實(shí)驗基礎?！拔蚁嘈旁诎l(fā)育過(guò)程中，經(jīng)常會(huì )有細胞出現惡變的情況，但大多數都安然無(wú)恙因為免疫系統保護著(zhù)我們。我也相信，這種先天免疫并不是抗菌體決定的，而是細胞層面的因素決定，這也就是為什么老年人群中癌癥更普遍”Burnet在自己的腫瘤免疫機制文章中如此說(shuō)。

許多科學(xué)家在鑒定淋巴細胞在防御惡變細胞過(guò)程中的重要性方面做了很多工作。確信的是，這種淋巴細胞的功能缺失會(huì )造成細胞癌變頻率變高，雖然強致癌物引起的細胞癌變免疫原性很強。盡管如此，試驗用的胸腺缺失的裸鼠并沒(méi)有更容易的自然患癌，因此未能驗證上述結論。另外，同時(shí)缺失T、B、NKT細胞的RAG基因敲除小鼠在18周齡時(shí)候自發(fā)患上胃腸上皮癌癥；免疫缺陷SCID小鼠患淋巴瘤的可能性更高，大約2%的老齡鼠患有各種非胸腺相關(guān)腫瘤。

目前已經(jīng)很明確了，就是免疫抑制人群，比如移植后免疫抑制治療患者，更容易患皮膚癌、宮頸癌和淋巴癌等惡性腫瘤。關(guān)鍵問(wèn)題就是：這是由于免疫監視缺失所致嗎，還是更容易受各種致癌病毒（HPV, HCV, EBV, HIV）的攻擊所致呢。

自發(fā)腫瘤細胞抗原大多數都是自身抗原，靶向這些抗原的淋巴細胞在胸腺中就被去除了。但這些抗原低親和力的一些特異性淋巴細胞有可能逃過(guò)胸腺去除過(guò)程遷移至外周，在外周中，這些細胞有可能被腫瘤細胞利用。一些自發(fā)腫瘤具有高突變頻率，因此有可能產(chǎn)生在胸腺中不存在的一些外源性新抗原（比如：BCR-Abl，突變的P53）。這種情況下T細胞和抗體免疫極有可能將其消滅。但不清楚這種點(diǎn)突變發(fā)生的概率多高。也有一些情況下，病原體誘導的特異性淋巴細胞也參與新型抗原免疫反應過(guò)程。

免疫監視機制相關(guān)的一系列發(fā)現都表明T細胞和B細胞抗體能識別并消除腫瘤。腫瘤是怎么形成的呢，因此就產(chǎn)生了癌癥免疫編輯學(xué)說(shuō)。學(xué)說(shuō)提出腫瘤發(fā)生的三個(gè)時(shí)期：消除期，平衡期和逃逸期。在第一個(gè)時(shí)期期間，腫瘤形成過(guò)程中被先天和后繼性免疫機制消除。即使未能對突變型腫瘤細胞進(jìn)行有效消除的話(huà)，后繼免疫依然可能將這些腫瘤細胞控制著(zhù)不生長(cháng)甚至長(cháng)達宿主一生的平衡期，而且不出現臨床表現。但持續對基因組不穩定的腫瘤細胞進(jìn)行免疫篩查，會(huì )導致突變體的形成，突變體通過(guò)下調抗原或MHC分子的表達、分泌免疫抑制細胞因子TGFβ和IL10、招募Treg細胞，而不再受效應T細胞識別控制。因此這些突變體細胞就發(fā)生逃逸并出現臨床表現。

腫瘤疫苗GVAX等被用于無(wú)或弱免疫原性腫瘤的治療。GVAX同時(shí)表達腫瘤抗原和另外兩種重要的輔助因子GM-CSF和PAMPs，輔助因子可以激活腫瘤細胞抗原低親和力的T細胞。這種疫苗與靶向Treg等抑制性細胞的化療藥物cyclophosphamide聯(lián)合，再結合CTLA-4和PD-1/PD-L1抗體，如果能有效誘導腫瘤特異性T細胞反應的話(huà)就有可能治愈腫瘤。但對低突變的腫瘤治療就更艱難。

對T細胞反應的研究產(chǎn)生了另一種腫瘤免疫治療方式，Rosenberg和同事開(kāi)辟性的利用患者自身的腫瘤浸潤淋巴細胞TIL治療腫瘤。在TIL治療過(guò)程中，黑色素瘤患者腫瘤組織中的T細胞被分離并進(jìn)行預處理后用IL-2因子進(jìn)行刺激培養。但這種方法并不適用于所有黑色素瘤患者和其它一些腫瘤的治療。對于EBV引起的淋巴增生（EBV感染的B細胞充當病毒性腫瘤抗原的APC細胞），腫瘤特異性T細胞已經(jīng)成功從健康人外周血分離并用于兼容型患者受體的治療。用于取代上述EBV感染的B細胞或DC細胞的人工APC系統被開(kāi)發(fā)出并用于T細胞的篩選和擴增。

T細胞激活機制成就檢驗點(diǎn)抑制和T細胞修飾免疫療法

絕大部分自發(fā)形成的腫瘤細胞都會(huì )表達自身抗原并使其遞呈于MHC分子表面。具有這些抗原分子高親和力TCR的T細胞在胸腺中負選擇性的刪除。在高突變率的黑色素瘤中，有些突變蛋白發(fā)生改變而作為非自身抗原表達于細胞表面，因此被CD8+ T細胞識別。那為什么這些腫瘤細胞沒(méi)有被激活的CD8細胞殺滅呢？對T細胞激活的分子機制的各種研究逐漸解開(kāi)這個(gè)謎題并為增強或重獲T細胞功能提供有力支點(diǎn)。

T細胞激活起始需要兩種信號，一種來(lái)源于MHC分子與APC細胞的相互作用，另一種來(lái)源T細胞共刺激分子CD28與APC細胞表面的CD80和CD86受體相互作用。還有一些共刺激分子受體對T細胞擴增和記憶性T細胞的維持很重要。激活信號分子和共刺激信號分子終將成就如今兩種不同的抗癌武器，其一是以單克隆抗體技術(shù)為基礎，另一種以基因改造技術(shù)為基礎。

扭轉腫瘤保護性免疫抑制

在正常情況下，T細胞反應會(huì )受到抑制性檢驗點(diǎn)的調控，包括CTLA-4（CD152）、PD-1（CD279）、BTLA（CD272）等，防止細胞毒性效應細胞的過(guò)度增殖和殺傷以及自身免疫。

CTLA-4分子通過(guò)與CD28競爭CD80和CD86配體機制調控初始T細胞和記憶T細胞的激活起始階段，即抗原遞呈后的24-48小時(shí)。CTLA-4通過(guò)剝奪CD28共刺激分子的胞外受體抑制共刺激信號。CTLA-4表達于T細胞表面，主要功能是下調CD4 Th細胞活性和增強Treg細胞介導的免疫抑制作用。人體中CTLA-4的缺失或突變均會(huì )導致各種自身免疫疾病的發(fā)生。近期研究發(fā)現，在伴有低丙球蛋白血癥、反復感染、多發(fā)性自身免疫的常見(jiàn)變異型免疫缺陷綜合癥的一種更常見(jiàn)的亞型中鑒定出CTLA-4基因exon1中存在雜合型無(wú)義突變。

PD-1在T細胞激活和慢性抗原對T細胞持續刺激后表達，用于限制活性T細胞的活性。與CTLA-4不同，PD-1不但在所有T細胞中表達，同時(shí)也在活化的B、NKT細胞中表達。PD-1的主要功能體現在感染引起的炎癥反應過(guò)程中。一些病毒感染引起的慢性抗原刺激會(huì )誘導抗原特異性活性T細胞疲態(tài)。另外，炎癥組織會(huì )誘導PD-1配體分子（PD-L1， PD-L2）的表達，從而下調T細胞活性防止過(guò)度免疫和自身免疫。與CTLA-4相似，PD-1基因突變也會(huì )導致自身免疫疾病的發(fā)生。

理論上，這些抑制性檢驗點(diǎn)的拮抗劑能使T細胞更有效的增殖并控制病毒感染和腫瘤的發(fā)生。但CTLA-4或PD-1的增強劑也有可能防止自身免疫、過(guò)敏和移植排斥反應的發(fā)生。在很多腫瘤中，腫瘤細胞會(huì )表達PD-L1與PD-1相互作用限制相應的T細胞反應。此外，腫瘤微環(huán)境中活性T細胞分泌的IFN-γ會(huì )上調腫瘤細胞和間質(zhì)細胞中PD-L1的表達。專(zhuān)職抑制T細胞活性的Treg細胞也會(huì )被招募到腫瘤微環(huán)境中，對腫瘤浸潤細胞毒性T細胞進(jìn)行抑制。而Treg更是高水平表達CTLA-4和PD-1分子，這更加增強了Treg細胞對T細胞的抑制作用。因此這些受體也是抗體介導Treg細胞消除的靶點(diǎn)（圖2）。小鼠Treg細胞CTLA-4基因的缺失會(huì )導致系統性淋巴增生、致死性自身免疫和IgE異常分泌等疾病的發(fā)生，但同時(shí)也促進(jìn)了腫瘤免疫反應。另外，T細胞的Sema4a和Treg細胞的Nrp1互作會(huì )促進(jìn)Treg細胞功能和存活。Nrp1是Treg細胞抑制抗腫瘤免疫反應的必需因子，因此Sema4a-Nrp1信號是消除Treg細胞介導的腫瘤免疫耐受的潛在靶點(diǎn)。

抑制性髓源細胞在一些腫瘤中也會(huì )發(fā)生積累并抑制抗腫瘤免疫反應。

圖2. 抗體介導的T細胞免疫反應中負調控因子的抑制作用示意圖

單克隆抗體技術(shù)衍生出了多種靶向細胞表面分子的免疫療法。尤其是近期火熱的CTLA-4和PD-1/PD-L1抗體，通過(guò)使T細胞掙脫增殖的限制，促進(jìn)其對腫瘤細胞的殺傷。早在1996年，Allison首次用CTLA-4抗體在小鼠模型恢復了小鼠的抗腫瘤免疫能力。治療轉移性黑色素瘤的CTLA-4抗體主要有兩種，ipilimumab和tremelimumab。PD-1/PD-L1抗體目前有八種在進(jìn)行臨床試驗：靶向PD-1的nivolumab, pembrolizumab/MK-3475, pidilizumab和AMP-224，以及靶向PD-L1的BMS-935559, MEDI4736, MPDL3280A和MSB0010718C。另外，靶向其它檢驗點(diǎn)分子TIM3，LAG3，VISTA抗體以及T細胞共刺激分子OX40和CD137增強劑也正被嘗試用于腫瘤免疫治療。同時(shí)靶向CTLA-4和PD-1的抗體治療在一些黑色素瘤患者的治療中，展現出更好的療效。

靶向Treg細胞高表達的趨化因子受體CCR4的單抗和PI3激酶抑制劑對檢驗點(diǎn)抑制抗體有協(xié)助功能，從而激活T細胞并用于癌癥的免疫治療。

T細胞修飾的應用前景

轉基因技術(shù)的出現，尤其是采用γ-慢病毒載體對人T淋巴細胞進(jìn)行基因改造，使得T細胞修飾相關(guān)的免疫療法成為可能?；颊逿細胞，很容易從外周血中獲得，進(jìn)行TCR或CAR改造后可以重新靶向腫瘤細胞。兩種方法在靶向CD19治療急性淋巴細胞白血病和靶向NY-ESO1治療黑色素瘤中都取得成功。

CARs是人工將組合抗原受體與B細胞和T細胞抗原識別機制整合形成。突破HLA限制的CAR具有極其誘人的應用前景，可以用于所有HLA型的患者，與TCR不同，CAR同時(shí)還能克服腫瘤細胞下調的HLA分子使得T細胞胞內TCR配體缺失障礙。CARs的核心功能在于，不僅介導T細胞靶向腫瘤抗原，還增強T細胞的功能。因此，與共刺激分子整合借助共刺激分子信號來(lái)增強T細胞功能能有效提高CARs的效果。

二代CARs在B細胞惡性腫瘤的臨床治療中展現了良好的效果，命名為第二代CAR是為了強調其CD3ζ鏈融合的共刺激分子受體。這些分子的進(jìn)化主要有三個(gè)階段。當Weiss等人克隆出了CD3ζ鏈時(shí)候，新發(fā)現的T細胞特異性鏈缺少胞外區域，因此與CD8、CD4或CD25進(jìn)行融合表達，從而使得抗體介導的交叉ζ鏈融合受體成為可能。這些研究使用的是白血病T細胞，并發(fā)現ζ鏈具有激活功能。后來(lái)Eshhar等人首次報道Ig源性的scFv片段的添加賦予了這種融合受體不同的結合能力，從而使轉染的雜交瘤T細胞獲得新的特異性。有了這些技術(shù)之后，我們就可以檢測ζ鏈CAR的臨床功能特性。我們發(fā)現這些ζ鏈CAR即使受到抗原刺激也無(wú)法介導T細胞的擴增，這也符合T細胞激活需要兩種信號刺激理論和一代CAR在小鼠模型上得出的結論。這促使我們將T細胞共刺激分子與CAR聯(lián)合，締造雙重信號的受體，我們發(fā)現雙重信號的CAR在抗原反復刺激的情況下能增強外周血T細胞的增殖和功能。當時(shí)的這些研究為后期功能性T細胞的修飾成功鋪墊（圖3）。新型二代CAR具有令人興奮的腫瘤免疫治療前景。近期也有文章對CD19 CAR進(jìn)行了綜述。CAR治療目前正指向其他血液疾病和實(shí)體瘤，包括沒(méi)有新抗原的惡性腫瘤，希望能更有效的抑制腫瘤生長(cháng)。

圖3. T細胞修飾和CAR的改造原理示意圖

CAR也還可以與共刺激分子配體、嵌合共刺激受體或細胞因子IL-15、IL-2等聯(lián)合使用，進(jìn)一步增強T細胞的功能、特異性和安全性。與CAR不同，CCR不是通過(guò)激活T細胞，而是打破凋亡機制使T細胞更長(cháng)時(shí)間生存，起到靶向抗原的作用?？乖禺愋砸种剖荏w，比如CTLA-4和PD-1相關(guān)的iCAR進(jìn)一步為重組受體治療拓寬視野。

將來(lái)有可能將胸腺相關(guān)機制和細胞修飾更好的聯(lián)合，體外重建胸腺成熟技術(shù)、多能干細胞誘導分化形成T細胞技術(shù)等都將為多功能、兼容性更強T細胞的產(chǎn)業(yè)化打下堅實(shí)的基礎。

展望

轉化醫學(xué)領(lǐng)域科學(xué)家們已經(jīng)成功的將基礎研究成果轉化應用于各種疾病，尤其是癌癥的臨床治療中。當初沒(méi)人想得到，對病毒感染引起的白血病的研究會(huì )揭示出新生小鼠胸腺的免疫功能。后來(lái)，全球性的研究對我們如今了解到的T細胞激活調控機制及其臨床應用都有重要的推動(dòng)作用。單克隆抗體和轉基因技術(shù)的誕生使得T、B細胞抗原識別、T細胞激活、T細胞共刺激信號相關(guān)機制應用于檢驗點(diǎn)抑制和CAR-T細胞療法成為可能。盡管一些重要的分子信號通路和細胞間的相互作用已經(jīng)清晰明了，但還需要更多的探索發(fā)現，還需要進(jìn)行更多的免疫研究。免疫學(xué)孕育了免疫治療，免疫治療也將繼外科手術(shù)、放射治療、化學(xué)藥物治療之后在腫瘤的治療大殿中占有重要的一席之地。

本文轉載自公眾號：上海細胞治療工程技術(shù)研究中心

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