核酸（nucleic acid）是重要的生物大分子，是生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究的重要對象和領(lǐng)域。由于核酸的結構和功能比較復雜，分子很不穩定，在細胞中的含量又比較小，在四類(lèi)生物大分子中，它的研究開(kāi)始最晚?，F代生物化學(xué)建立于18世紀下半葉?！暗鞍踪|(zhì)”一詞最早于1838年，由J.J.Berzelius提出，“核酸”這個(gè)詞出現要晚半個(gè)世紀。1868年瑞士外科醫師米歇（Friedrich Miescher）由膿細胞中分離提取出一種含磷量很高的酸性物質(zhì)，稱(chēng)為核素（nuclein），繼任者發(fā)展了制備不含蛋白質(zhì)的核酸的方法，1889年R.Altmann最早提出“核酸”（nucleic acid）一詞。核酸的研究改變了整個(gè)生命科學(xué)的面貌，并由此誕生了分子生物學(xué)這一當今發(fā)展最迅速、最有活力的學(xué)科?！?/p>
核酸分為兩大類(lèi)：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）和核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）。RNA根據其結構和功能的不同主要分為三類(lèi)：信使RNA(messenger RNA,mRNA)、轉運RNA(transfer RNA,tRNA)和核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)。DNA是遺傳信息的貯存和攜帶者，RNA主要是轉錄、傳遞DNA上的遺傳信息，直接參與細胞蛋白質(zhì)的的生物合成。在真核細胞中，DNA絕大部分（約98%）存在于細胞核染色質(zhì)中，其余分布于細胞器（如線(xiàn)粒體、葉綠體）中；RNA絕大部分（約90%）分布在細胞質(zhì)中，其余分布在細胞核內。
核酸是由什么組成的？
核酸是生物體內的高分子化合物。它包括脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）和核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）兩大類(lèi)。DNA和RNA都是由一個(gè)一個(gè)核苷酸(nucleotide)頭尾相連而形成的。RNA平均長(cháng)度大約為2000個(gè)核苷酸，而人的DNA卻是很長(cháng)的，約有3X109個(gè)核苷酸。
單個(gè)核苷酸是由含氮有機堿(稱(chēng)堿基)、戊糖(即五碳糖)和磷酸三部分構成的。
堿基(base)：構成核苷酸的堿基分為嘌呤（purine)和嘧啶 >（pyrimi-dine)二類(lèi)。前者主要指腺嘌呤（adenine，A）和鳥(niǎo)嘌呤（guanine,G），DNA和RNA中均含有這二種堿基。后者主要指胞嘧啶（cytosine,C）胸腺嘧啶（thymine，T）和尿嘧啶（uracil,U），胞嘧啶存在于DNA和RNA中，胸腺嘧啶只存在于DNA中，尿嘧啶則只存在于RNA中。這五種堿基的結構如圖。
嘌呤環(huán)上的N-9或嘧啶環(huán)上的N-1是構成核苷酸時(shí)與核糖（或脫氧核糖）形成糖苷鍵的位置。
此外，核酸分子中還發(fā)現數十種修飾堿基（themodifiedcomponent),又稱(chēng)稀有堿基，(unusualcomponent)。它是指上述五種堿基環(huán)上的某一位置被一些化學(xué)基團（如甲基化、甲硫基化等）修飾后的衍生物。一般這些堿基在核酸中的含量稀少，在各種類(lèi)型核酸中的分布也不均一。如DNA中的修飾堿基主要見(jiàn)于噬菌體DNA，RNA中以tRNA含修飾堿基最多。
戊糖(五碳糖):RNA中的戊糖是D－核糖(即在2號位上連接的是一個(gè)羥基)，DNA中的戊糖是D－2－脫氧核糖(即在2號位上只連一個(gè)H)。D－核糖的Ｃ－2所連的羥基脫去氧就是D－2脫氧核糖。
戊糖Ｃ－1所連的羥基是與堿基形成糖苷鍵的基團，糖苷鍵的連接都是β－構型。
核苷（nucleoside)：由D－核糖或D－2脫氧核糖與嘌呤或嘧啶通過(guò)糖苷鍵連接組成的化合物。核酸中的主要核苷有八種。
核苷酸(nucleotide)：核苷酸與磷酸殘基構成的化合物，即核苷的磷酸酯。核苷酸是核酸分子的結構單元。核酸分子中的磷酸酯鍵是在戊糖C-3’和C-5’所連的羥基上形成的，故構成核酸的核苷酸可視為3’－核苷酸或5’－核苷酸。DNA分子中是含有A,G,C,T四種堿基的脫氧核苷酸；RNA分子中則是含A,G,C,U四種堿基的核苷酸。
當然核酸分子中的核苷酸都以形式存在，但在細胞內有多種游離的核苷酸，其中包括一磷酸核苷、二磷核苷和三磷酸核苷。
核苷酸是怎么連接的？
3’，5’－磷酸二酯鍵：核酸是由眾多核苷酸聚合而成的多聚核苷酸（polynucleotide），相鄰二個(gè)核苷酸之間的連接鍵即：3’，5’－磷酸二酯鍵。這種連接可理解為核苷酸糖基上的3＇位羥基與相鄰5＇核苷酸的磷酸殘基之間，以及核苷酸糖基上的5＇位羥基與相鄰3＇核苷酸的磷酸殘基之間形成的兩個(gè)酯鍵。多個(gè)核苷酸殘基以這種方式連接而成的鏈式分子就是核酸。無(wú)論是DNA還是ＲＮＡ，其基本結構都是如此，故又稱(chēng)DNA鏈或RNA鏈。DNA鏈的結構如下示意圖。
寡核苷酸（oligonucleotide)：這是與核酸有關(guān)的文獻中經(jīng)常出現的一個(gè)術(shù)語(yǔ)，一般是指二至十個(gè)核苷酸殘基以磷酸二酯鍵連接而成的線(xiàn)性多核苷酸片段。但在使用這一術(shù)語(yǔ)時(shí)，對核苷酸殘基的數目并無(wú)嚴格規定，在不少文獻中，把含有三十甚至更多個(gè)核苷酸殘基的多核苷酸分子也稱(chēng)作寡核苷酸。寡核苷酸目前已可由儀器自動(dòng)合成，它可作為DNA合成的引物（primer)、基因探針（probe)等，在現代分子生物學(xué)研究中具有廣泛的用途。
核酸鏈的簡(jiǎn)寫(xiě)式：核酸分子的簡(jiǎn)寫(xiě)式是為了更簡(jiǎn)單明了的敘述高度復雜的核酸分子而使用的一些簡(jiǎn)單表示式。它所要表示的主要內容是核酸鏈中的核苷酸（或堿基）。下面介紹二種常用的簡(jiǎn)寫(xiě)式。
字符式：書(shū)寫(xiě)一條多核苷酸鏈時(shí)，用英文大寫(xiě)字母縮寫(xiě)符號代表堿基（DNA和RNA中所含主要堿基及縮寫(xiě)符號見(jiàn)表１－１），用小寫(xiě)英文字母P代表磷酸殘基。核酸分子中的糖基、糖苷鍵和酯鍵等均省略不寫(xiě)，將堿基和磷酸相間排列即可。因省略了糖基，故不再注解“脫氧”與否，凡簡(jiǎn)寫(xiě)式中出現Ｔ就視為DNA鏈，出現Ｕ則視為RNA鏈。以5＇和3＇表示鏈的末端及方向，分別置于簡(jiǎn)寫(xiě)式的左右二端。下面是分別代表DNA鏈和RNA鏈片段的二個(gè)簡(jiǎn)寫(xiě)式：
5＇pＡpＣpＴpＴpＧpＡpＡpＣpＧ3＇DNA
5＇pＡpＣpＵpＵpＧpＡpＡpＣpＧ3＇RNA
此式可進(jìn)一步簡(jiǎn)化為：
5＇pＡＣＴＴＧＡＡＣＧ3＇
5＇pＡＣＵＵＧＡＡＣＧ3＇
上述簡(jiǎn)寫(xiě)式的5＇－末端均含有一個(gè)磷酸殘基（與糖基的Ｃ－5＇位上的羥基相連）,3＇－末端含有一個(gè)自由羥基（與糖基的Ｃ－3＇位相連）,若5＇端不寫(xiě)Ｐ，則表示5＇－末端為自由羥基。雙鏈DNA分子的簡(jiǎn)寫(xiě)式多采用省略了磷酸殘基的寫(xiě)法，在上述簡(jiǎn)式的基礎上再增加一條互補鏈（complentarystrand)即可，鏈間的配對堿基用短縱線(xiàn)相連或省略，錯配（mismatch)堿基對錯行書(shū)寫(xiě)在互補鏈的上下兩邊，如下所示：
5＇ＧＧＡＡＴＣＴＣＡＴ3＇
3＇ＣＣＴＴＡＧＡＧＴＡ5＇
5＇ＧＧＡＡＴＣ錯配）
線(xiàn)條式：在字符書(shū)寫(xiě)基礎上，以垂線(xiàn)（位于堿基之下）和斜線(xiàn)（位于垂線(xiàn)與Ｐ之間）分別表示糖基和磷酸酯鍵。如下圖所示
上式中，斜線(xiàn)與垂線(xiàn)部的交點(diǎn)為糖基的Ｃ－3＇位，斜線(xiàn)與垂線(xiàn)下端的交點(diǎn)為糖基的Ｃ－5＇位。這一書(shū)寫(xiě)式也可用于表示短鏈片段。不難看出，簡(jiǎn)寫(xiě)式表示的中心含義就是核酸分子的一級結構，即核酸分子中的核苷酸（或堿基）排列順序。
核酸是一種多聚核苷酸，它的基本結構是核苷酸（nucleotide）。采用不同的降解法，可以將核酸降解成核苷酸，核苷酸還可以進(jìn)一步降解為核苷和磷酸。核苷再進(jìn)一步分解生成含氮堿基（base）和戊糖。堿基分兩大類(lèi)：嘌呤堿和嘧啶堿。所以，核酸由核苷酸組成，而核苷酸又由堿基、戊糖與磷酸組成。
一、核苷酸
核苷酸可分為核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸兩類(lèi)。兩者基本化學(xué)結構相同，只是所含戊糖不同，個(gè)別堿基不同。核糖核苷酸是RNA的結構單位，脫氧核糖核苷酸是DNA的結構單位。細胞內還有各種游離的核苷酸和核苷酸衍生物，他們具有重要的生理功能。由此可見(jiàn)，對于核酸和蛋白質(zhì)系統來(lái)說(shuō)，核苷酸相當于氨基酸，堿基相當于氨基酸的功能基團（氨基酸側鏈）?！?/p>
核酸是一類(lèi)由碳、氫、氧、氮和磷組成的化合物。其中磷在各種核酸中的含量比較恒定，DNA的平均含磷量為9.9%，RNA的平均含磷量為9.4%。因此，只要測出核酸樣品的含磷量，就可以計算出該樣品的核酸含量?！?/p>
（一）戊糖
戊糖有D-核糖（D-ribose,R）和D-2-脫氧核糖（D-2-deoxyribose,dR）兩種。在核苷酸中，碳原子的編號加撇號(如1’、2’)等以與堿基上不加撇號的碳原子相區別。
（二）含氮堿
核酸中的含氮堿稱(chēng)堿基，包括嘌呤堿和嘧啶堿兩類(lèi)。嘌呤堿主要有腺嘌呤（adenine,A）和鳥(niǎo)嘌呤（gaunine,G）。 嘧啶堿主要有胞嘧啶（cytosine,C）、尿嘧啶（uracil,U）和胸腺嘧啶（thymine,?T）。含氮堿雜環(huán)中C和N的編號以不加撇號的1，2，3……表示。某些核酸分子中含有一些微量的稀有堿基，如2-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5，6二氫尿嘧啶等（表3-1-2）。這些堿基可能是正常堿基被化學(xué)修飾形成的，或復制轉錄過(guò)程中摻入的非正常堿基。目前已知稀有堿基和核苷達近百種。
（三）核苷(nucleoside)
戊糖和堿基通過(guò)糖苷鍵連接而成核苷。糖苷鍵是由戊糖C-1′上的羥基與嘌呤堿N-9或嘧啶堿N-1上的氫原子經(jīng)脫水縮合形成。核苷根據其所含戊糖的不同分為核糖核苷和脫氧核糖核苷。其中腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷的結構式如圖3--3所示。由稀有堿基形成的核苷稱(chēng)稀有核苷，如假尿嘧啶核苷、次黃嘌呤核苷等。
（四）核苷酸(nucleotide)
核苷和磷酸通過(guò)磷酸酯鍵連接而成核苷酸。核糖核苷的戊糖有三個(gè)自由羥基，可形成三種核苷酸：2′-、3′-和5′-核糖核苷酸。脫氧核糖核苷的戊糖只有兩個(gè)自由羥基，只能形成兩種核苷酸：3′-和5′-脫氧核糖核苷酸。生物體內游離存在的核苷酸大多數是5′-核苷酸（5′-?？墒÷圆粚?xiě)）。核糖核苷酸是組成RNA的基本單位，脫氧核糖核苷酸是組成DNA的基本單位。
二、其他核苷酸
（一）多磷酸核苷
生物體內各種5′-核苷酸和5′-脫氧核苷酸還可以在5′位上進(jìn)一步磷酸化，形成二磷酸核苷（NDP和dNDP）和三磷酸核苷（NTP和dNTP）。其中NTP是合成RNA的原料，dNTP是合成DNA的原料。ATP(adenosine triphosphate)是體內最重要的高能化合物，分子中含有三個(gè)磷酸酯鍵，其中α-磷酸酯鍵為低能磷酸酯鍵，而β、γ磷酸酯鍵都是高能磷酸酯鍵。每1mol高能磷酸化合物水解時(shí)可釋放出自由能大于20.93kJ。ATP是人體內各種生命活動(dòng)的主要的直接供能者。
（二）輔酶類(lèi)核苷酸
體內代謝反應中的一些輔酶，也是核苷酸的衍生物。例如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）、黃素腺嘌呤二核酸（FAD）、輔酶A（HSCoA）等，其分子中都含有腺苷酸。這些輔酶類(lèi)核苷酸均參與物質(zhì)代謝中氫和某些化學(xué)基團的傳遞?！?/p>
（三）環(huán)化核苷酸
組織細胞中還發(fā)現了兩種環(huán)化核苷酸：3′，5′-環(huán)化腺苷酸（cAMP）和3′，5′-環(huán)化鳥(niǎo)苷酸(cGMP)。它們的含量甚微，但具有重要的生理活性，是一些激素作用的第二信使，在細胞信號轉導過(guò)程中具有重要調控作用。
核酸（nucleic acid）是重要的生物大分子，它的構件分子是核苷酸（nucleotide）。
天然存在的核酸可分為：
╭ 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）
╰ 核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）
DNA貯存細胞所有的遺傳信息，是物種保持進(jìn)化和世代繁衍的物質(zhì)基礎。
RNA中參與蛋白質(zhì)合成的有三類(lèi)：
╭ 轉移RNA（transfer RNA，tRNA）
∣ 核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）
╰ 信使RNA（messenger RNA，mRNA）
20世紀末，發(fā)現許多新的具有特殊功能的RNA，幾乎涉及細胞功能的各個(gè)方面。
核苷酸可分為：
╭ 核糖核苷酸：是RNA的構件分子
╰ 脫氧核糖核苷酸：是DNA構件分子。
細胞內還有各種游離的核苷酸和核苷酸衍生物，它們具有重要的生理功能。
核苷酸由：
╭ 核苷（nucleoside）
╰ 磷酸（Phosphonic.acid）
核苷由：
╭ 堿基（base）
╰ 戊糖（Pentose）
堿基（base）：
構成核苷酸中的堿基是含氮雜環(huán)化合物，由嘧啶（pyrimidine）和嘌呤（purine）構成。
核酸：
╭ 嘌呤堿 ：
╭ 腺嘌呤
∣ ╰ 鳥(niǎo)嘌呤
╰ 嘧啶堿 ：
╭ 胞嘧啶
∣ 胸腺嘧啶
╰ 尿嘧啶
╭ DNA中含有腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶，胸腺嘧啶主要存在于DNA中。
∣
╰ RNA中含有腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶，尿嘧啶主要存在于RNA中。
在某些tRNA分子中也有胸腺嘧啶，少數幾種噬菌體的DNA含尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。這五種堿基受介質(zhì)pH的影響出現酮式、烯醇式互變異構體。
在DNA和RNA中，尤其是tRNA中還有一些含量甚少的堿基，稱(chēng)為稀有堿基（rare bases）稀有堿基種類(lèi)很多，大多數是甲基化堿基。tRNA中含稀有堿基高達10%。
戊糖：
核酸中有兩種戊糖DNA中為D-2-脫氧核糖（D-2-deoxyribose），RNA中則為D-核糖（D-ribose）。在核苷酸中，為了與堿基中的碳原子編號相區別核糖或脫氧核糖中碳原子標以C-1’，C-2’等。脫氧核糖與核糖兩者的差別只在于脫氧核糖中與2’位碳原子連結的不是羥基而是氫，這一差別使DNA在化學(xué)上比RNA穩定得多。
核苷：
核苷是戊糖與堿基之間以糖苷鍵（glycosidic bond）相連接而成。戊糖中C-1’與嘧啶堿的N-1或者與嘌吟堿的N9相連接，戊糖與堿基間的連接鍵是N-C鍵，一般稱(chēng)為N-糖苷鍵。
RNA中含有稀有堿基，并且還存在異構化的核苷。如在tRNA和rRNA中含有少量假尿嘧啶核苷（用ψ表示），在它的結構中戊糖的C-1不是與尿嘧啶的N-1相連接，而是與尿嘧啶C-5相連接。
核苷酸：
核苷中的戊糖5’碳原子上羥基被磷酸酯化形成核苷酸。核苷酸分為核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸兩大類(lèi)。依磷酸基團的多少，有一磷酸核苷、二磷酸核苷、三磷酸核苷。核苷酸在體內除構成核酸外，尚有一些游離核苷酸參與物質(zhì)代謝、能量代謝與代謝調節，如三磷酸腺苷（ATP）是體內重要能量載體；三磷酸尿苷參與糖原的合成；三磷酸胞苷參與磷脂的合成；環(huán)腺苷酸（cAMP）和環(huán)鳥(niǎo)苷酸（cGMP）作為第二信使，在信號傳遞過(guò)程中起重要作用；核苷酸還參與某些生物活性物質(zhì)的組成：如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+），尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。
一個(gè)核苷酸分子戊糖的3′-羥基和另一個(gè)核苷酸分子戊糖的5′-磷酸可脫水縮合形成3′,5′-磷酸二酯鍵。許多核苷酸借助于磷酸二酯鍵相連形成的化合物稱(chēng)為多聚核苷酸。多聚核苷酸呈線(xiàn)狀展開(kāi)，稱(chēng)為多聚核苷酸鏈，它是核酸的基本結構形式。多聚核苷酸鏈有兩個(gè)末端，戊糖5′位帶有游離磷酸基的稱(chēng)為5′末端，戊糖3′位帶有游離羥基的一端稱(chēng)為3′末端。
一、DNA的分子結構
（一）DNA的堿基組成特點(diǎn)
在50年代初，經(jīng)Chargaff等人的分析研究表明，DNA的堿基組成有下列一些特點(diǎn)：
1．各種生物的DNA分子中腺嘌呤與胸腺嘧啶的摩爾數相等，即A=T；鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶的摩爾數相等，即G=C。因此，嘌呤堿的總數等于嘧啶堿的總數，即A+G=C+T。
2．DNA的堿基組成具有種屬特異性，即不同生物種屬的DNA具有各自特異的堿基組成，如人、牛和大腸桿菌的DNA堿基組成比例是不一樣的。
3．DNA的堿基組成沒(méi)有組織器官特異性，即同一生物體的各種不同器官或組織DNA的堿基組成相似。比如牛的肝、胰、脾、腎和胸腺等器官的DNA的堿基組成十分相近而無(wú)明顯差別。
4．生物體內的堿基組成一般不受年齡、生長(cháng)狀況、營(yíng)養狀況和環(huán)境等條件的影響。這就是說(shuō)，每種生物的DNA具有各自特異的堿基組成，與生物的遺傳特性有關(guān)。
DNA堿基組成的這些規律稱(chēng)Chargaff規則，這些規則為研究DNA雙螺旋結構提供了重要依據?！?/p>
（二）一級結構
DNA是由許多脫氧核糖核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接起來(lái)的多聚核苷酸。DNA分子中脫氧核糖核苷酸的排列順序，稱(chēng)為DNA的一級結構。它是形成二級結構和三級結構的基礎?！?/p>
（三）二級結構
DNA的二級結構是一個(gè)雙螺旋結構，其結構模型于1953年由美國的Watson和英國的Crick兩位科學(xué)家共同提出，從本質(zhì)上揭示了生物遺傳性狀得以世代相傳的分子奧秘。其基本內容如下：
1．主干鏈反向平行：DNA分子是一個(gè)由兩條平行的脫氧多核苷酸鏈圍繞同一個(gè)中心軸盤(pán)曲形成的右手螺旋結構，兩條鏈行走方向相反，一條鏈為5′→3′走向，另一條鏈為3′→5′走向。磷酸基和脫氧核糖基構成鏈的骨架，位于雙螺旋的外側；堿基位于雙螺旋的內側。堿基平面與中軸垂直。
2．側鏈堿基互補配對：兩條脫氧多核苷酸鏈通過(guò)堿基之間的氫鍵連接在一起。堿基之間有嚴格的配對規律：A與T配對，其間形成兩個(gè)氫鍵；G與C配對，其間形成三個(gè)氫鍵。這種配對規律，稱(chēng)為堿基互補配對原則。每一堿基對的兩個(gè)堿基稱(chēng)為互補堿基，同一DNA分子的兩條脫氧多核苷酸鏈稱(chēng)為互補鏈。
3．雙螺旋立體結構：DNA雙螺旋的直徑為2nm，一圈螺旋含10個(gè)堿基對，每一堿基平面間的軸向距離為0.34nm，故每一螺旋的螺距為3.4nm，每個(gè)堿基的旋轉角度為36°。維持DNA結構穩定的力量主要是堿基對之間的堆積力，堿基對之間的氫鍵也起著(zhù)重要作用。
（四）三級結構
DNA雙螺旋進(jìn)一步盤(pán)曲形成更加復雜的結構，稱(chēng)為DNA的三級結構。絕大部分原核生物的DNA都是共價(jià)封閉的環(huán)狀雙螺旋分子，這種雙螺旋分子還需再次螺旋化形成超螺旋結構。超螺旋是DNA三級結構的最常見(jiàn)的形式。超螺旋方向與雙螺旋方向相反，使螺旋變松者，叫做負超螺旋；超螺旋方向與雙螺旋方向相同，使螺旋變緊者，叫做正超螺旋。在真核生物的染色質(zhì)中，DNA的三級結構與蛋白質(zhì)的結合有關(guān)。構成染色質(zhì)的基本單位是核小體。核小體由核小體核心和連接區組成。核小體核心由組蛋白八聚體（由H2A、H2B、H3、H4各兩分子組成）和盤(pán)繞其上的一段約含146堿基對（base pair,bp）的DNA雙鏈組成，連接區含有組蛋白H1和一小段DNA雙鏈（約60個(gè)堿基對）。核小體彼此相連成串珠狀染色質(zhì)細絲，染色質(zhì)細絲螺旋化形成染色質(zhì)纖維，后者進(jìn)一步卷曲、折疊形成染色單體。這樣，DNA的長(cháng)度被壓縮近萬(wàn)倍。
二、RNA的分子結構
RNA分子中相鄰的兩個(gè)核糖核苷酸也是以3′，5′-磷酸二酯鍵連接形成多聚核糖核苷酸鏈。RNA的一級結構是指多聚核糖核苷酸鏈中核糖核苷酸的排列順序。RNA分子是單鏈結構，其核苷酸殘基數目在數十至數千之間，分子量一般在數百至數百萬(wàn)之間?！?/p>
RNA的多核苷酸鏈可以在某些部分彎曲折疊，形成局部雙螺旋結構，此即RNA的二級結構。在RNA的局部雙螺旋區，腺嘌呤（A）與尿嘧啶（U）、鳥(niǎo)嘌呤（G）與胞嘧啶（C）之間進(jìn)行配對，無(wú)法配對的區域以環(huán)狀形式突起。這種短的雙螺旋區域和環(huán)狀突起稱(chēng)為發(fā)夾結構。RNA在二級結構的基礎上進(jìn)一步彎曲折疊就形成各自特有的三級結構?！?/p>
（一）tRNA的結構特點(diǎn)
tRNA約含70~100個(gè)核苷酸殘基，是分子量最小的RNA，占RNA總量的16%，現已發(fā)現有100多種。tRNA的主要生物學(xué)功能是轉運活化了的氨基酸，參與蛋白質(zhì)的生物合成?！?/p>
各種tRNA的一級結構互不相同，但它們的二級結構都呈三葉草形。這種三葉草形結構的主要特征是，含有四個(gè)螺旋區、三個(gè)環(huán)和一個(gè)附加叉。四個(gè)螺旋區構成四個(gè)臂，其中含有3′末端的螺旋區稱(chēng)為氨基酸臂，因為此臂的3′-末端都是C-C-A-OH序列，可與氨基酸連接。三個(gè)環(huán)分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。環(huán)Ⅰ含有5，6二氫尿嘧啶，稱(chēng)為二氫尿嘧啶環(huán)（DHU環(huán)）。環(huán)Ⅱ頂端含有由三個(gè)堿基組成的反密碼子，稱(chēng)為反密碼環(huán)；反密碼子可識別mRNA分子上的密碼子，在蛋白質(zhì)生物合成中起重要的翻譯作用。環(huán)Ⅲ含有胸苷（T）、假尿苷（ψ）、胞苷（C），稱(chēng)為T(mén)ψC環(huán)；此環(huán)可能與結合核糖體有關(guān)。tRNA在二級結構的基礎上進(jìn)一步折疊成為倒“L”字母形的三級結構?！?/p>
tRNA分子中稀有堿基的數量是所有核酸分子中比例最高的，這些稀有堿基的來(lái)源是轉錄之后經(jīng)過(guò)加工修飾形成的。
（二）mRNA的結構特點(diǎn)
mRNA的含量最少，約占RNA總量的2%。mRNA一般都不穩定，代謝活躍，更新迅速，半衰期短。mRNA分子中從5′-未端到3′-未端每三個(gè)相鄰的核苷酸組成的三聯(lián)體代表氨基酸信息，稱(chēng)為密碼子。mRNA的生物學(xué)功能是傳遞DNA的遺傳信息，指導蛋白質(zhì)的生物合成。細胞內mRNA的種類(lèi)很多，分子大小不一，由幾百至幾千個(gè)核苷酸組成。真核生物mRNA的一級結構有如下特點(diǎn)：
1．mRNA的3′-未端有一段含30~200個(gè)核苷酸殘基組成的多聚腺苷酸（polyA）。此段polyA不是直接從DNA轉錄而來(lái)，而是轉錄后逐個(gè)添加上去的。有人把polyA稱(chēng)為mRNA的“靴”。原核生物一般無(wú)polyA的結構。此結構與mRNA由胞核轉位胞質(zhì)及維持mRNA的結構穩定有關(guān)，它的長(cháng)度決定mRNA的半衰期。
2．mRNA的5′-未端有一個(gè)7-甲基鳥(niǎo)嘌呤核苷三磷酸（m7Gppp）的“帽”式結構。此結構在蛋白質(zhì)的生物合成過(guò)程中可促進(jìn)核蛋白體與mRNA的結合，加速翻譯起始速度，并增強mRNA的穩定性，防止mRNA從頭水解?！?/p>
在細胞核內合成的mRNA初級產(chǎn)物被稱(chēng)為不均一核RNA（hnRNA）,它們在核內迅速被加工、剪接成為成熟的mRNA并透出核膜到細胞質(zhì)?！?/p>
3、rRNA的結構特點(diǎn)
rRNA是細胞中含量最多的RNA，約占RNA總量的82%。rRNA單獨存在時(shí)不執行其功能，它與多種蛋白質(zhì)結合成核糖體，作為蛋白質(zhì)生物合成的“裝配機”?！?/p>
rRNA的分子量較大，結構相當復雜，目前雖已測出不少rRNA分子的一級結構，但對其二級、三級結構及其功能的研究還需進(jìn)一步的深入。原核生物的rRNA分三類(lèi)：5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA。真核生物的rRNA分四類(lèi)：5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。S為大分子物質(zhì)在超速離心沉降中的一個(gè)物理學(xué)單位，可間接反應分子量的大小。原核生物和真核生物的核糖體均由大、小兩種亞基組成。
過(guò)去認為，大亞基的蛋白質(zhì)具有酶的活性，促使肽鍵形成，故稱(chēng)為轉肽酶。20世紀90年代初，H.F.Noller等證明大腸桿菌的23SrRNA能夠催化肽鍵的形成，才證明核糖體是一種核酶，從而根本改變了傳統的觀(guān)點(diǎn)。核糖體催化肽鍵合成的是rRNA，蛋白質(zhì)只是維持rRNA構象，起輔助的作用。
三、 DNA的空間結構
(一)DNA的二級結構
DNA二級結構即雙螺旋結構（double helix structure）。20世紀50年代初Chargaff等人分析多種生物DNA的堿基組成發(fā)現的規則。
DNA雙螺旋模型的提出不僅揭示了遺傳信息穩定傳遞中DNA半保留復制的機制，而且是分子生物學(xué)發(fā)展的里程碑。
DNA雙螺旋結構特點(diǎn)如下：①兩條DNA互補鏈反向平行。②由脫氧核糖和磷酸間隔相連而成的親水骨架在螺旋分子的外側，而疏水的堿基對則在螺旋分子內部，堿基平面與螺旋軸垂直，螺旋旋轉一周正好為10個(gè)堿基對，螺距為3.4nm，這樣相鄰堿基平面間隔為0.34nm并有一個(gè)36?的夾角。③DNA雙螺旋的表面存在一個(gè)大溝（major groove）和一個(gè)小溝（minor groove），蛋白質(zhì)分子通過(guò)這兩個(gè)溝與堿基相識別。④兩條DNA鏈依靠彼此堿基之間形成的氫鍵而結合在一起。根據堿基結構特征，只能形成嘌呤與嘧啶配對，即A與T相配對，形成2個(gè)氫鍵；G與C相配對，形成3個(gè)氫鍵。因此G與C之間的連接較為穩定。⑤DNA雙螺旋結構比較穩定。維持這種穩定性主要靠堿基對之間的氫鍵以及堿基的堆集力（stacking force）。
生理條件下，DNA雙螺旋大多以B型形式存在。右手雙螺旋DNA除B型外還有A型、C型、D型、E型。此外還發(fā)現左手雙螺旋Z型DNA。Z型DNA是1979年Rich等在研究人工合成的CGCGCG的晶體結構時(shí)發(fā)現的。Z-DNA的特點(diǎn)是兩條反向平行的多核苷酸互補鏈組成的螺旋呈鋸齒形，其表面只有一條深溝，每旋轉一周是12個(gè)堿基對。研究表明在生物體內的DNA分子中確實(shí)存在Z-DNA區域，其功能可能與基因表達的調控有關(guān)。DNA二級結構還存在三股螺旋DNA，三股螺旋DNA中通常是一條同型寡核苷酸與寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸雙螺旋的大溝結合，三股螺旋中的第三股可以來(lái)自分子間，也可以來(lái)自分子內。三股螺旋DNA存在于基因調控區和其他重要區域，因此具有重要生理意義。
?。ǘ?DNA三級結構——超螺旋結構
DNA三級結構是指DNA鏈進(jìn)一步扭曲盤(pán)旋形成超螺旋結構。生物體內有些DNA是以雙鏈環(huán)狀DNA形式存在，如有些病毒DNA，某些噬菌體DNA，細菌染色體與細菌中質(zhì)粒DNA，真核細胞中的線(xiàn)粒體DNA、葉綠體DNA都是環(huán)狀的。環(huán)狀DNA分子可以是共價(jià)閉合環(huán)，即環(huán)上沒(méi)有缺口，也可以是缺口環(huán)，環(huán)上有一個(gè)或多個(gè)缺口。在DNA雙螺旋結構基礎上，共價(jià)閉合環(huán)DNA（covalently close circular DNA）可以進(jìn)一步扭曲形成超螺旋形（super helical form）。根據螺旋的方向可分為正超螺旋和負超螺旋。正超螺旋使雙螺旋結構更緊密，雙螺旋圈數增加，而負超螺旋可以減少雙螺旋的圈數。幾乎所有天然DNA中都存在負超螺旋結構。
?。ㄈ?DNA的四級結構——DNA與蛋白質(zhì)形成復合物
在真核生物中其基因組DNA要比原核生物大得多，如原核生物大腸桿菌的DNA約為4.7×103kb，而人的基因組DNA約為3×106 kb，因此真核生物基因組DNA通常與蛋白質(zhì)結合，經(jīng)過(guò)多層次反復折疊，壓縮近10 000倍后，以染色體形式存在于平均直徑為5μm的細胞核中。線(xiàn)性雙螺旋DNA折疊的第一層次是形成核小體（nucleosome）。猶如一串念珠, 核小體由直徑為11nm×5.5nm的組蛋白核心和盤(pán)繞在核心上的DNA構成。核心由組蛋白H2A、H2B、H3和H4各2分子組成，為八聚體，146 bp長(cháng)的 DNA以左手螺旋盤(pán)繞在組蛋白的核心1.75圈，形成核小體的核心顆粒，各核心顆粒間有一個(gè)連接區，約有60 bp雙螺旋DNA和1個(gè)分子組蛋白H1構成。平均每個(gè)核小體重復單位約占DNA 200 bp。DNA組裝成核小體其長(cháng)度約縮短7倍。在此基礎上核小體又進(jìn)一步盤(pán)繞折疊，最后形成染色體。
?。ㄋ模〥NA結構的多態(tài)性
?。譨tson和Crick所推導出來(lái)的DNA結構在生物學(xué)研究中有深遠意義。他們是以在生理鹽溶液中抽出的DNA纖維在92％相對溫度下進(jìn)行X－射線(xiàn)衍射圖譜為依據進(jìn)行推設的。在這一條件下得出的DNA稱(chēng)B構象。實(shí)際上在溶液中的DNA的確呈這一構象，這也是最常見(jiàn)的DNA構象。但是，研究表明DNA的結構是動(dòng)態(tài)的。在以鈉、鉀或銫作反離子，相對溫度為75％時(shí)，DNA分子的X－射線(xiàn)衍射圖給出的是A構象。這一構象不僅出現于脫水DNA中，還出現在RNA分子中的雙螺旋區域的DNA－RNA雜交分子中。如果以鋰作反離子，相對溫度進(jìn)一步降為66％，則DNA是C構象。但是這一構象僅在實(shí)驗室中觀(guān)察到，還未在生物體中發(fā)現。這些DNA分子中G-C堿基對較少，這些分子將取D和E構象。這些研究表明DNA的分子結構不是一成不變的，在不同的條件下可以有所不同。但是，這些不同構象的DNA都有共同的一點(diǎn)，即它們都是右手雙螺旋；兩條反向平行的核苷酸鏈通過(guò)Ｗatson-Crick堿基配對結合在一起；鏈的重復單位是單核苷酸；這些螺旋中都有兩個(gè)螺旋溝，分為大溝與小溝，只是它們的寬窄和深淺程度有所不同。
但是，Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG單晶的X－射線(xiàn)衍射圖譜時(shí)分別發(fā)現這種六聚體的構象與上面講到的完全不同。它是左手雙螺旋，在主鏈中各個(gè)磷酸根呈鋸齒狀排列，有如“之”字形一樣，因此叫它Z構象（英文字Zigzag的第一個(gè)字母）。還有，這一構象中的重復單位是二核苷酸而不是單核苷酸；而且Z－DNA只有一個(gè)螺旋溝，它相當于B構象中的小溝，它狹而深，大溝則不復存在。
立即就有幾個(gè)問(wèn)題被提了出來(lái)：這種結構是怎樣生成的？這一結構在天然狀態(tài)下存在嗎？它有什么生物學(xué)意義？
研究表明，Z－DNA的形成是DNA單鏈上出現嘌呤與嘧啶交替排列所成的。比如CGCGCGCG或者CACACACA。這種堿基排列方式會(huì )造成核苷酸的糖苷鍵的順式和反式構象的交替存在。當堿基與糖構成反式結構時(shí)，它們之間離得遠；而當它們成順式時(shí)，就彼此接近。嘧啶糖苷鍵通常是反式的，而嘌呤糖苷酸鍵既可成順式的也可成反式的。而在Z－DNA中，嘌呤堿是順式的。這樣，在Z－DNA中嘧啶的糖苷鏈離開(kāi)小溝向外挑出，而嘌呤上的糖苷鍵則彎向小溝。嘌呤與嘧啶的交替排列就使得糖苷鍵也是順式與反式交替排列，從而使Z－DNA主鏈呈鋸齒狀或“之”字形。
人們相信，并用實(shí)驗證明細胞DNA分子中確實(shí)存在有Z－DNA區。而且，細胞內有一些因素可以促使B－DNA轉變?yōu)閆－DNA。比如，胞嘧啶第五位碳原子的甲基化，在甲基周?chē)纬删植康氖杷畢^。這一區域擴伸到B－DNA的大溝中，使B－DNA不穩定而轉變?yōu)閆－DNA。這種C5甲基化現象在真核生物中是常見(jiàn)的。因此在生物B構象的DNA中某些區段具有Z－DNA構象是可能的。DNA真是一個(gè)構象可變動(dòng)態(tài)分子。
Z－DNA有會(huì )么生物學(xué)意義呢？應當指出Z－DNA的形成通常在熱力學(xué)上是不利的。因為Z－DNA中帶負電荷的磷酸根距離太近了，這會(huì )產(chǎn)物靜電排斥。但是，DNA鏈的局部不穩定區的存在就成為潛在的解鏈位點(diǎn)。DNA解螺旋卻是DNA復制和轉錄等過(guò)程中必要的環(huán)節，因此認為這一結構位點(diǎn)與基因調節有關(guān)。比如ＳＶ40增強子區中就有這種結構，又如鼠類(lèi)微小病毒ＤＮＳ復制區起始點(diǎn)附近有GC交替排列序列。此外，DNA螺旋上溝的特征在其信息表達過(guò)程中起關(guān)鍵作用。調控蛋白都是通過(guò)其分子上特定的氨基酸側鏈與DNA雙螺旋溝中的堿基對一側的氫原子供體或受體相互作用，形成氫鍵從而識別DNA上的遺傳信息的。大溝所帶的遺傳信息比小溝多。溝的寬窄和深淺也直接影響到調控蛋白質(zhì)對DNA信息的識別。Z－DNA中大溝消失，小溝狹而深，使調探蛋白識別方式也發(fā)生變化。這些都暗示Z－DNA的存在不僅僅是由于DNA中出現嘌呤－啶嘧交替排列之結果，也一定是在漫漫的進(jìn)化長(cháng)河中對DNA序列與結構不斷調整與篩選的結果，有其內在而深刻的含意，只是人們還未充分認識而已。
DNA構象的可變性，或者說(shuō)DNA二級結構的多態(tài)性的發(fā)現拓寬了人們的視野。原來(lái)，生物體中最為穩定的遺傳物質(zhì)也可以采用不同的姿態(tài)來(lái)實(shí)現其豐富多采的生物的奧妙，也讓人們在這一領(lǐng)域中探索和攀越時(shí)減少疲勞和厭倦，樂(lè )而忘返，從而有更多更新的發(fā)現。
多年來(lái)，DNA結構的研究手段主要是X射線(xiàn)衍線(xiàn)技術(shù),其結果是通過(guò)間接觀(guān)測多個(gè)DNA分子有關(guān)結構參數的平均值而獲得的。同時(shí)，這項技術(shù)的樣品分析條件使被測DNA分子與天然狀態(tài)相差甚遠。因此，在反映DNA結構真實(shí)性方面這種方法存在著(zhù)缺陷。1989年,應用掃描隧道顯微鏡(STM)研究DNA結構克服了上述技術(shù)的缺陷。這種先進(jìn)的顯微技術(shù),不僅可將被測物放大500萬(wàn)倍,且能直接觀(guān)測接近天然條件下單個(gè)DNA分子的結構細節。應該說(shuō)它所取得的DNA結構資料更具有"權威性"。表1-6是STM測到的B-DNA結構參數及其與X射線(xiàn)衍線(xiàn)資料的比較結果。STM研究還證實(shí)了d(CG)重復序列的寡核苷酸片段為Z-DNA結構的事實(shí)。STM技術(shù)的應用是DNA結構研究中的重要進(jìn)展,可望在探索DNA結構的某些未知點(diǎn)上展示巨大潛力。
四、基因與基因組
?。ㄒ唬?基因（gene）的現代分子生物學(xué)概念是指能編碼有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或合成RNA所必需的全部核酸序列，是核酸分子的功能單位。一個(gè)基因通常包括編碼蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA的編碼序列，保證轉錄和加工所必需的調控序列和5’端、3’端非編碼序列。另外在真核生物基因中還有內含子等核酸序列。
?。ǘ┗蚪M（genome）是指一個(gè)細胞或病毒所有基因及間隔序列，儲存了一個(gè)物種所有的遺傳信息。在病毒中通常是一個(gè)核酸分子的堿基序列，單細胞原核生物是它僅有的一條染色體的堿基序列，而多細胞真核生物是一個(gè)單倍體細胞內所有的染色體。如人單倍體細胞的23條染色體的堿基序列。多細胞真核生物起源于同一個(gè)受精卵，其每個(gè)體細胞的基因組都是相同的。
1. 病毒基因組
2.原核生物基因組
3.真核生物基因組
在高等真核生物中基因序列占整個(gè)基因組不到10%，大部分是非編碼的間隔序列。人類(lèi)基因組研究結果發(fā)現在人的基因組中與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的基因只占整個(gè)基因組2 %。真核生物基因組的最大的特點(diǎn)是出現分隔開(kāi)的基因，在這類(lèi)基因中有編碼作用的序列稱(chēng)外顯子（exon），沒(méi)有編碼作用的序列稱(chēng)內含子（intron），它們彼此間隔排列。
五、各類(lèi)RNA的結構
絕大部分RNA分子都是線(xiàn)狀單鏈，但是RNA分子的某些區域可自身回折進(jìn)行堿基互補配對，形成局部雙螺旋。在RNA局部雙螺旋中A與U配對、G與C配對，除此以外，還存在非標準配對，如G與U配對。RNA分子中的雙螺旋與A型DNA雙螺旋相似，而非互補區則膨脹形成凸出（bulge）或者環(huán)（loop），這種短的雙螺旋區域和環(huán)稱(chēng)為發(fā)夾結構（hairpin）。發(fā)夾結構是RNA中最普通的二級結構形式，二級結構進(jìn)一步折疊形成三級結構，RNA只有在具有三級結構時(shí)才能成為有活性的分子。RNA也能與蛋白質(zhì)形成核蛋白復合物，RNA的四級結構是RNA與蛋白質(zhì)的相互作用。
?。ㄒ唬?tRNA的結構
tRNA約占總RNA的15%，tRNA主要的生理功能是在蛋白質(zhì)生物合成中轉運氨基酸和識別密碼子，細胞內每種氨基酸都有其相應的一種或幾種tRNA， 因此tRNA的種類(lèi)很多，在細菌中約有30~40種tRNA，在動(dòng)物和植物中約有50~100種tRNA。
1. tRNA一級結構：
tRNA是單鏈分子，含73~93核苷酸，分子質(zhì)量為24 000～31 000，沉降系數4S。含有10%的稀有堿基。如二氫尿嘧啶（DHU）、核糖胸腺嘧啶（rT）和假尿苷（ψ）以及不少堿基被甲基化, 其3’端為CCA-OH，5’端多為pG, 分子中大約30%的堿基是不變的或半不變的，也就是說(shuō)它們的堿基類(lèi)型是保守的。
2. tRNA二級結構：
tRNA二級結構為三葉草型。配對堿基形成局部雙螺旋而構成臂，不配對的單鏈部分則形成環(huán)。三葉草型結構由4臂4環(huán)組成。氨基酸臂由7對堿基組成，雙螺旋區的3’末端為一個(gè)4個(gè)堿基的單鏈區-NCCA-OH 3’，腺苷酸殘基的羥基可與氨基酸α羧基結合而攜帶氨基酸。二氫尿嘧啶環(huán)以含有2個(gè)稀有堿基二氫尿嘧啶（DHU）而得名，不同tRNA其大小并不恒定，在8-14個(gè)堿基之間變動(dòng)，二氫尿嘧啶臂一般由3~4對堿基組成。反密碼環(huán)由7個(gè)堿基組成，大小相對恒定，其中3個(gè)核苷酸組成反密碼子（anticodon），在蛋白質(zhì)生物合成時(shí)，可與mRNA上相應的密碼子配對。反密碼臂由5對堿基組成。額外環(huán)在不同tRNA分子中變化較大可在4~21個(gè)堿基之間變動(dòng)，又稱(chēng)為可變環(huán)，其大小往往是tRNA分類(lèi)的重要指標。TψC環(huán)含有7個(gè)堿基，大小相對恒定，幾乎所有的tRNA在此環(huán)中都含TψC序列，TψC臂由5對堿基組成。
3. tRNA的三級結構：
二十世紀七十年代初科學(xué)家用X線(xiàn)射衍技術(shù)分析發(fā)現tRNA的三級結構為倒L形（圖3-20b）。tRNA三級結構的特點(diǎn)是氨基酸臂與TψC臂構成L的一橫，-CCAOH3’末端就在這一橫的端點(diǎn)上，是結合氨基酸的部位，而二氫尿嘧啶臂與反密碼臂及反密碼環(huán)共同構成L的一豎，反密碼環(huán)在一豎的端點(diǎn)上，能與mRNA上對應的密碼子識別，二氫尿嘧啶環(huán)與TψC環(huán)在L的拐角上。形成三級結構的很多氫鍵與tRNA中不變的核苷酸密切有關(guān)，這就使得各種tRNA三級結構都呈倒L形的。在tRNA中堿基堆積力是穩定tRNA構型的主要因素。
?。ǘ﹎RNA
原核生物中mRNA轉錄后一般不需加工，直接進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯。mRNA轉錄和翻譯不僅發(fā)生在同一細胞空間，而且這兩個(gè)過(guò)程幾乎是同時(shí)進(jìn)行的。真核細胞成熟mRNA是由其前體核內不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）剪接并經(jīng)修飾后才能進(jìn)入細胞質(zhì)中參與蛋白質(zhì)合成。所以真核細胞mRNA的合成和表達發(fā)生在不同的空間和時(shí)間。mRNA的結構在原核生物中和真核生物中差別很大。下面分別作一介紹：
1. 原核生物mRNA結構特點(diǎn)
原核生物的mRNA結構簡(jiǎn)單，往往含有幾個(gè)功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的編碼序列，可翻譯出幾種蛋白質(zhì)，為多順?lè )醋?。在原核生物mRNA中編碼序列之間有間隔序列，可能與核糖體的識別和結合有關(guān)。在5’端與3’端有與翻譯起始和終止有關(guān)的非編碼序列，原核生物mRNA中沒(méi)有修飾堿基， 5’端沒(méi)有帽子結構，3’端沒(méi)有多聚腺苷酸的尾巴（polyadenylate tail，polyA尾巴）。原核生物的mRNA的半衰期比真核生物的要短得多，現在一般認為，轉錄后1min，mRNA降解就開(kāi)始。
2. 真核生物mRNA結構特點(diǎn)
真核生物mRNA為單順?lè )醋咏Y構，即一個(gè)mRNA分子只包含一條多肽鏈的信息。在真核生物成熟的mRNA中5’端有m7GpppN的帽子結構，帽子結構可保護mRNA不被核酸外切酶水解，并且能與帽結合蛋白結合識別核糖體并與之結合，與翻譯起始有關(guān)。3’端有polyA尾巴，其長(cháng)度為20~250個(gè)腺苷酸，其功能可能與mRNA的穩定性有關(guān)，少數成熟mRNA沒(méi)有polyA尾巴，如組蛋白mRNA，它們的半衰期通常較短。
?。ㄈ﹔RNA的結構
rRNA占細胞總RNA的80%左右，rRNA分子為單鏈，局部有雙螺旋區域（圖3-22）具有復雜的空間結構，原核生物主要的rRNA有三種，即5S、16S和23S rRNA，如大腸桿菌的這三種rRNA分別由120、1542和2904個(gè)核苷酸組成。真核生物則有4種，即5S、5.8S、18S和28S rRNA, 如小鼠，它們相應含121、158、1874和4718個(gè)核苷酸。rRNA分子作為骨架與多種核糖體蛋白（ribosomal protein）裝配成核糖體。
所有生物體的核糖體都由大小不同的兩個(gè)亞基所組成。原核生物核糖體為70S，由50S和30S兩個(gè)大小亞基組成。30S小亞基含16S的rRNA和21種蛋白質(zhì)，50S大亞基含23S和5S兩種rRNA及34種蛋白質(zhì)。真核生物核糖體為80S，是由60S和40S兩個(gè)大小亞基組成。40S的小亞基含18S rRNA及33種蛋白質(zhì)，60S大亞基則由28S、5.8S和5S ３種rRNA及49種蛋白質(zhì)組成。
?。ㄋ模┢渌鸕NA分子
20世紀80年代以后由于新技術(shù)不斷產(chǎn)生，人們發(fā)現RNA有許多新的功能和新的RNA基因。細胞核內小分子RNA（small nuclear RNA，snRNA）是細胞核內核蛋白顆粒（Small nuclear ribonucleoprotein particles，snRNPs）的組成成分，參與mRNA前體的剪接以及成熟的mRNA由核內向胞漿中轉運的過(guò)程。核仁小分子RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）是類(lèi)新的核酸調控分子, 參與rRNA前體的加工以及核糖體亞基的裝配。胞質(zhì)小分子RNA（small cytosol RNA， scRNA）的種類(lèi)很多，其中7S LRNA與蛋白質(zhì)一起組成信號識別顆粒（signal recognition particle，SRP）, SRP參與分泌性蛋白質(zhì)的合成，反義RNA（antisense RNA）由于它們可以與特異的mRNA序列互補配對，阻斷mRNA翻譯，能調節基因表達。核酶是具有催化活性的RNA分子或RNA片段。目前在醫學(xué)研究中已設計了針對病毒的致病基因mRNA的核酶，抑制其蛋白質(zhì)的生物合成，為基因治療開(kāi)辟新的途徑，核酶的發(fā)現也推動(dòng)了生物起源的研究。微RNA（microRNA，miRNA）是一種具有莖環(huán)結構的非編碼RNA，長(cháng)度一般為20-24個(gè)核苷酸，在mRNA翻譯過(guò)程中起到開(kāi)關(guān)作用，它可以與靶mRNA結合，產(chǎn)生轉錄后基因沉默作用（post-transcriptional gene silencing，PTGS），在一定條件下能釋放，這樣mRNA又能翻譯蛋白質(zhì)，由于miRNA的表達具有階段特異性和組織特異性，它們在基因表達調控和控制個(gè)體發(fā)育中起重要作用。
六、RNA組
隨著(zhù)基因組研究不斷深入，蛋白組學(xué)研究逐漸展開(kāi)，RNA的研究也取得了突破性的進(jìn)展，發(fā)現了許多新的RNA分子，人們逐漸認識到DNA是攜帶遺傳信息分子，蛋白質(zhì)是執行生物學(xué)功能分子，而RNA即是信息分子，又是功能分子。人類(lèi)基因組研究結果表明，在人類(lèi)基因組中約有30000～40000個(gè)基因，其中與蛋白質(zhì)生物合成有關(guān)的基因只占整個(gè)基因組的2%，對不編碼蛋白質(zhì)的98%基因組的功能有待進(jìn)一步研究，為此20世紀末科學(xué)家在提出蛋白質(zhì)組學(xué)后，又提出RNA組學(xué)。RNA組是研究細胞的全部RNA基因和RNA的分子結構與功能。目前RNA組的研究尚處在初級階段，RNA組的研究將在探索生命奧秘中做出巨大貢獻。
核酸的性質(zhì) (包括化學(xué)、物理、以及光譜學(xué)和熱力學(xué))：
a.化學(xué)：
?、?酸效應：在強酸和高溫，核酸完全水解為堿基，核糖或脫氧核糖和磷酸。在濃度略稀的的無(wú)機酸中，最易水解的化學(xué)鍵被選擇性的斷裂，一般為連接嘌呤和核糖的糖苷鍵，從而產(chǎn)生脫嘌呤核酸。
?、?堿效應
1. DNA:當PH值超出生理范圍（PH7~8）時(shí)，對DNA結構將產(chǎn)生更為微妙的影響。堿效應使剪輯的互變異構態(tài)發(fā)生變化。這種變化影響到特定堿基間的氫鍵作用，結果導致DNA雙鏈的解離，稱(chēng)為DNA的變性
2. RNA：PH較高時(shí)，同樣的變性發(fā)生在RNA的螺旋區域中，但通常被RNA的堿性水解所掩蓋。這是因為RNA存在的2`-OH參與到對磷酸脂鍵中磷酸分子的分子內攻擊，從而導致RNA的斷裂。
?、?化學(xué)變性：一些化學(xué)物質(zhì)能夠使DNA/RNA在中性PH下變性。由堆積的疏水剪輯形成的核酸二級結構在能量上的穩定性被削弱，則核酸變性。
b.物理：
?、?黏性：DNA的高軸比等性質(zhì)使得其水溶液具有高黏性，很長(cháng)的DNA分子又易于被機械力或超聲波損傷，同時(shí)黏度下降。
?、?浮力密度：可根據DNA的密度對其進(jìn)行純化和分析。在高濃度分子質(zhì)量的鹽溶液（CsCl）中，DNA具有與溶液大致相同的密度，將溶液高速離心，則CsCl趨于沉降于底部，從而建立密度梯度，而DNA最終沉降于其浮力密度相應的位置，形成狹帶，這種技術(shù)成為平衡密度梯度離心或等密度梯度離心。
c.光譜學(xué)：
?、?減色性：dsDNA相對于ssDNA是減色的，而ssDNA相對于dsDNA是增色的。
?、?DNA純度：A260/A280。
d.熱力學(xué)：
?、?熱變性：dsDNA與RNA的熱力學(xué)表現不同，隨著(zhù)溫度的升高RNA中雙鏈部分的堿基堆積會(huì )逐漸地減少，其吸光性值也逐漸地，不規則地增大。較短的堿基配對區域具有更高的熱力學(xué)活性，因而與較長(cháng)的區域相比變性快。而dsDNA熱變性是一個(gè)協(xié)同過(guò)程。分子末端以及內部更為活躍的富含A-T的區域的變性將會(huì )使其赴京的螺旋變得不穩定，從而導致整個(gè)分子結構在解鏈溫度下共同變性。
?、?復性：DNA的熱變性可通過(guò)冷卻溶液的方法復原。不同核酸鏈之間的互補部分的復性稱(chēng)為雜交。
一、 核酸的大小和測定
一般來(lái)說(shuō)，進(jìn)化程度高的生物DNA分子應越大，能貯存更多遺傳信息。但進(jìn)化的復雜程度與DNA大小并不完全一致，如哺乳類(lèi)動(dòng)物DNA約為3×109 bp，但有些兩棲類(lèi)動(dòng)物、南美肺魚(yú)DNA大小可達1010bp到1011bp。
常用測定DNA分子大小的方法有電泳法、離心法。凝膠電泳是當前研究核酸的最常用方法，凝膠電泳有瓊脂糖（agarose）凝膠電泳和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠電泳。
二、核酸的水解
DNA和RNA中的糖苷鍵與磷酸酯鍵都能用化學(xué)法和酶法水解。在很低pH條件下DNA和RNA都會(huì )發(fā)生磷酸二酯鍵水解。并且堿基和核糖之間的糖苷鍵更易被水解，其中嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶堿的糖苷鍵對酸更不穩定。在高pH時(shí)，RNA的磷酸酯鍵易被水解，而DNA的磷酸酯鍵不易被水解。
水解核酸的酶有很多種，若按底物專(zhuān)一性分類(lèi)，作用于RNA的稱(chēng)為核糖核酸酶（ribonuclease，RNase），作用于DNA的則稱(chēng)為脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）。按對底物作用方式分類(lèi),可分核酸內切酶（endonuclease）與核酸外切酶（exonuclease）。核酸內切酶的作用是在多核苷酸內部的3’，5’磷酸二酯鍵，有些內切酶能識別DNA雙鏈上特異序列并水解有關(guān)的3’，5’磷酸二酯鍵。核酸內切酶是非常重要的工具酶，在基因工程中有廣泛用途。而核酸外切酶只對核酸末端的3’，5’磷酸二酯鍵有作用，將核苷酸一個(gè)一個(gè)切下，可分為5’→3’外切酶，與3’→5’外切酶。
三、核酸的變性、復性和雜交
?。ㄒ唬?變性
在一定理化因素作用下，核酸雙螺旋等空間結構中堿基之間的氫鍵斷裂，變成單鏈的現象稱(chēng)為變性（denaturation）。引起核酸變性的常見(jiàn)理化因素有加熱、酸、堿、尿素和甲酰胺等。在變性過(guò)程中，核酸的空間構象被破壞，理化性質(zhì)發(fā)生改變。由于雙螺旋分子內部的堿基暴露，其A260值會(huì )大大增加。A260值的增加與解鏈程度有一定比例關(guān)系，這種關(guān)系稱(chēng)為增色效應（hyperchromic effect）。如果緩慢加熱DNA溶液，并在不同溫度測定其A260值，可得到 “S”形DNA熔化曲線(xiàn)（melting curve）。從DNA熔化曲線(xiàn)可見(jiàn)DNA變性作用是在一個(gè)相當窄的溫度內完成的。
當A260值開(kāi)始上升前DNA是雙螺旋結構，在上升區域分子中的部分堿基對開(kāi)始斷裂，其數值隨溫度的升高而增加，在上部平坦的初始部分尚有少量堿基對使兩條鏈還結合在一起，這種狀態(tài)一直維持到臨界溫度，此時(shí)DNA分子最后一個(gè)堿基對斷開(kāi)，兩條互補鏈徹底分離。通常把加熱變性時(shí)DNA溶液A260升高達到最大值一半時(shí)的溫度稱(chēng)為該DNA的熔解溫度（melting temperature Tm），Tm是研究核酸變性很有用的參數。Tm一般在85～95℃之間，Tm值與DNA分子中G C含量成正比。
?。ǘ?復性
變性DNA在適當條件下，可使兩條分開(kāi)的單鏈重新形成雙螺旋DNA的過(guò)程稱(chēng)為復性（renaturation）。當熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后復性稱(chēng)為退火（annealing）。DNA復性是非常復雜的過(guò)程，影響DNA復性速度的因素很多：DNA濃度高，復性快；DNA分子大復性慢；高溫會(huì )使DNA變性，而溫度過(guò)低可使誤配對不能分離等等。最佳的復性溫度為T(mén)m減去25℃，一般在60℃左右。離子強度一般在0.4mol/L以上。
?。ㄈ?雜交
具有互補序列的不同來(lái)源的單鏈核酸分子，按堿基配對原則結合在一起稱(chēng)為雜交（hybridization）。雜交可發(fā)生在DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA之間。雜交是分子生物學(xué)研究中常用的技術(shù)之一，利用它可以分析基因組織的結構，定位和基因表達等，常用的雜交方法有Southern印跡法，Northern印跡法和原位雜交（insitu hybridization）等。
在某些理化因素的作用下，DNA分子中的堿基堆積力和氫鍵斷裂，空間結構被破壞，從而引起理化性質(zhì)和生物學(xué)功能的改變，這種現象稱(chēng)為核酸的變性。能引起DNA變性的理化因素有加熱、pH值改變、乙醇、尿素等。DNA發(fā)生變性后，雙螺旋被解開(kāi)，有更多的堿基共軛雙鍵暴露，對波長(cháng)260nm的紫外光吸收增強，這種現象稱(chēng)為增色效應。如果在連續加熱DNA的過(guò)程中以溫度對紫外光吸收值作圖，所得的曲線(xiàn)稱(chēng)為解鏈曲線(xiàn)（圖3-3-1）。從曲線(xiàn)中可以看出，DNA的變性從開(kāi)始解鏈到完全解鏈，是在一個(gè)相當狹窄的溫度內完成，在這一范圍內，紫外光吸收值達到最大值的50%時(shí)的溫度稱(chēng)為DNA的解鏈溫度，由于這一現象和結晶的融解過(guò)程類(lèi)似，又稱(chēng)融解溫度（Tm）。在Tm時(shí)，核酸分子內50%的雙鏈結構被解開(kāi)。DNA的Tm值一般在70℃~85℃之間。DNA的Tm值大小與DNA分子中G、C的含量有關(guān)，因為G—C之間有三個(gè)氫鍵，而A—T之間只有二個(gè)氫鍵，所以G、C越多的DNA，其分子結構越穩定，Tm值較高。變性DNA在適宜條件下，兩條彼此分開(kāi)的鏈經(jīng)堿基互補可重新形成雙螺旋結構，這一過(guò)程稱(chēng)為復性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻即可復性，這一過(guò)程也稱(chēng)為退火。最適宜的復性溫度比Tm約低25℃，這個(gè)溫度叫做退火溫度。
不同來(lái)源的核酸變性后，合并在一起進(jìn)行復性，只要它們存在大致相同的堿基互補配對序列，就可形成雜化雙鏈，此過(guò)程叫做雜交。雜交分子可以是DNA/DNA、DNA/RNA或RNA/DNA。用同位素標記一個(gè)已知序列的寡核苷酸，通過(guò)雜交反應就可確定待測核酸是否含有與之相同的序列，這種被標記的寡核苷酸，叫做探針。雜交和探針技術(shù)對核酸結構和功能的研究，對遺傳性疾病的診斷，對腫瘤病因學(xué)及基因工程的研究已有比較廣泛的應用。
(1)DNA的變性：
指DNA分子由穩定的雙螺旋結構松解為無(wú)規則線(xiàn)性結構的現象。確切地就是維持雙螺旋穩定性的氫鍵和疏水鍵的斷裂。斷裂可以是部分的或全部的，是可逆的或是非可逆的。DNA變性不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩定性的因素都可以成為變性的條件，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等,均可破壞雙螺旋結構引起核酸分子變性。變性能導致DNA 以下一些理化及生物學(xué)性質(zhì)的改變。
溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的"剛性"結構,變性后代之以“柔軟” 而松散的無(wú)規則單股線(xiàn)性結構，DNA粘度因此而明顯下降。
溶液旋光性發(fā)生改變。變性后整個(gè)DNA分子的對稱(chēng)性及分子局部的構性改變, 使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。
增色效應或高色效應(hyperchromic effect)。指變性后DNA 溶液的紫外吸收作用增強的效應。DNA分子具有吸收250－280nm波長(cháng)的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。DNA分子中堿基間電子的相互作用是紫外吸收的結構基礎,但雙螺旋結構有序堆積的堿基又"束縛"了這種作用。變 性DNA 的雙鏈解開(kāi),堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收,故而產(chǎn)生增色效應。一般以260nm下的紫外吸收光密度作為觀(guān)測此效應的指標,變性后該指標的觀(guān)測值通常較變性前有明顯增加, 但不同來(lái)源DNA的變化不一,如大腸桿菌DNA經(jīng)熱變性后,其260nm的光密度值可增加40%以上, 其它不同來(lái)源的DNA溶液的增值范圍多在20－30%之間。
以加熱為變性條件時(shí),增色效應與溫度有十分密切的關(guān)系,這主要是變性溫度取決于DNA自身的性質(zhì)。熱變性使DNA分子雙鏈解開(kāi)所需溫度稱(chēng)為熔解溫度( melting temperature,簡(jiǎn)寫(xiě)Tm)。因熱變性是在很狹的溫度范圍內突發(fā)的躍變過(guò)程, 很像結晶達到熔點(diǎn)時(shí)的熔化現象,故名熔解溫度。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖,得到的典型DNA變性曲線(xiàn)呈S型。S型曲線(xiàn)下方平坦段,表示DNA的氫鍵未被破壞,待加熱到某一溫度處時(shí),次級鍵突發(fā)斷開(kāi),DNA迅速解鏈,同時(shí)伴隨吸光率急劇上升,此后因"無(wú)鏈可解"而出現溫度效應喪失的上方平坦段。Tm定義中包含了使被測DNA的50%發(fā)生變性的意義,即增色效應達到一半的溫度作為T(mén)m,它在S型曲線(xiàn)上,相當于吸光率增加的中點(diǎn)處所對應的橫坐標。不同來(lái)源DNA間的Tm存在差別,在溶劑相同的前提下,這種差別主要是由DNA本身下列兩方面的性質(zhì)所造成的。(1)DNA的均一性。有二種含義，首先是指DNA分子中堿基組成的均一性,如人工合成的只含有一種堿基對的多核苷酸片段,與天然DNA比較,其Tm值范圍就較窄。因前者在變性時(shí)的氫鏈斷裂幾乎可"齊同"進(jìn)行,故所要求的變性溫度更趨于一致。其次還包含有待測樣品DNA的組成是否均一的意思,如樣品中只含有一種病毒DNA,其Tm值范圍較窄, 若混雜有其它來(lái)源的DNA,則Tm值范圍較寬。其原因顯然也與DNA的堿基組成有關(guān)。 總的說(shuō),DNA均一性,變性的DNA鏈各部分的氫鍵斷裂所需能量較接近,Tm值范圍較窄,反之亦然。(2)DNA的(G+C)含量。在溶劑固定的前提下，Tm值的高低取決于DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高,即G-C堿基對越多,Tm值越高。此點(diǎn)是易于理解的,因G-C堿基對具有3對氫鍵,而A-T堿基對只有2對氫鍵,DNA中(G+C)含量高顯然更能增強結構的穩定性,破壞G-C間氫鍵需比A-T氫鍵付出更多的能量,故(G+C)含量高的DNA,其變性Tm也高。實(shí)驗說(shuō)明,Tm與DNA中(G+C)含量存在著(zhù)密切相關(guān)性(圖1-16),從中可看出,變性溫度受到溶液離子強度的影響。Tm與(G+C)含量(X)百分數的這種關(guān)系可用以下經(jīng)驗公式表示(DNA溶于0.2mol/L NaCl中):
X%(G+C)=2.44(Tm-69.3)
(2)DNA的復性：
指變性DNA 在適當條件下,二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象,它是變性的一種逆轉過(guò)程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復性,此過(guò)程稱(chēng)之為" 退火"(annealing)。這一術(shù)語(yǔ)也用以描述雜交核酸分子的形成(見(jiàn)后)。DNA的復性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響。以下簡(jiǎn)要說(shuō)明之。
溫度和時(shí)間。變性DNA溶液在比Tm低25℃的溫度下維持一段長(cháng)時(shí)間,其吸光率會(huì )逐漸降低。將此DNA再加熱,其變性曲線(xiàn)特征可以基本恢復到第一次變性曲線(xiàn)的圖形。這表明復性是相當理想的。一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復性的最佳條件,越遠離此溫度,復性速度就越慢。在很低的溫度(如4℃以下)下,分子的熱運動(dòng)顯著(zhù)減弱互補鏈結合的機會(huì )自然大大減少。從熱運動(dòng)的角度考慮,維持在Tm以下較高溫度,更有利于復性。復性時(shí)溫度下降必須是一緩慢過(guò)程,若在超過(guò)Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下),復性幾乎是及不可能的,核酸實(shí)驗中經(jīng)常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態(tài)。這說(shuō)明降溫時(shí)間太短以及溫差大均不利于復性。
DNA濃度。復性的第一步是兩個(gè)單鏈分子間的相互作用“成核”。這一過(guò)程進(jìn)行的速度與DNA濃度的平方成正比。即溶液中DNA分子越多，相互碰撞結合“成核”的機會(huì )越大。
DNA順序的復雜性。簡(jiǎn)單順序的DNA分子,如多聚(A)和多聚(U)這二種單鏈序列復性時(shí),互補堿基的配對較易實(shí)現。而順序復雜的DNA,如小牛DNA的非重復部分,一般以單拷貝存在于基因組中,這種復雜特定序列要實(shí)現互補,顯然要比上述簡(jiǎn)單序列困難得多。在核酸復性研究中,定義了一個(gè)Cot的術(shù)語(yǔ),(Co為單鏈DNA的起始濃度,t是以秒為單位的時(shí)間),用以表示復性速度與DNA 順序復雜性的關(guān)系。在探討DNA順序對復性速度的影響時(shí),將溫度、溶劑離子強度、核酸片段大小等其它影響因素均予以固定,以不同程度的核酸分子重締合部分(在時(shí)間t時(shí)的復性率)取對數后對Cot作圖,可以得到如圖所示的曲線(xiàn),用非重復堿基對數表示核酸分子的復雜性。如多聚(A)的復雜性為1,重復的(ATGC)n組成的多聚體的復雜性為4,分子長(cháng)度是105核苷對的非重復DNA的復雜性為105。原核生物基因組均為非重復順序,故以非重復核苷酸對表示的復雜性直接與基因組大小成正比,對于真核生物基因組中的非重復片段也是如此。在標準條件下(一般為0.18ml/L陽(yáng)離子濃度,400核苷酸的長(cháng)的片段)測得的復性率達0.5時(shí)的Cot值(稱(chēng)Cotl/2),與核苷酸對的復雜性成正比。對于原核生物核酸分子，此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對的復雜程度。真核基因組中因含有許多不同程度的重復序列（repetitive sequence)，所得到的Cot曲線(xiàn)要上圖中的S曲線(xiàn)復雜。
(3)核酸分子雜交：
分子雜交(簡(jiǎn)稱(chēng)雜交,hybridization)是核酸研究中一項最基本的實(shí)驗技術(shù)。其基本原理就是應用核酸分子的變性和復性的性質(zhì),使來(lái)源不同的DNA(或RNA)片段,按堿基互補關(guān)系形成雜交雙鏈分子(heteroduplex)。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間,也可在RNA與DNA鏈之間形成。雜交的本質(zhì)就是在一定條件下使互補核酸鏈實(shí)現復性(加熱或堿處理)使雙螺旋解開(kāi)成為單鏈,因此,變性技術(shù)也是核酸雜交的一個(gè)環(huán)節。
若雜交的目的是識別靶DNA中的特異核苷酸序列,這需要牽涉到另一項核酸操作的基本技術(shù)─探針(probe)的制備。探針是指帶有某些標記物(如放射性同位素32P,熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素等)的特異性核酸序列片段。若我們設法使一個(gè)核酸序列帶上32P,那么它與靶序列互補形成的雜交雙鏈,就會(huì )帶有放射性。以適當方法接受來(lái)自雜交鏈的放射信號,即可對靶序列DNA的存在及其分子大小加以鑒別。在現代分子生物學(xué)實(shí)驗中,探針的制備和使用是與分子雜交相輔相成的技術(shù)手段。核酸分子雜交作為一項基本技術(shù),已應用于核酸結構與功能研究的各個(gè)方面。在醫學(xué)上,目前已用于多種遺傳性疾病的基因診斷(gene diagnosis),惡性腫瘤的基因分析,傳染病病原體的檢測等領(lǐng)域中,其成果大大促進(jìn)了現代醫學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展。
DNA（為英文Deoxyribonucleic acid的縮寫(xiě)）,又稱(chēng)脫氧核糖核酸，是染色體的主要化學(xué)成分，同時(shí)也是基因組成的，有時(shí)被稱(chēng)為“遺傳微?！?。DNA是一種分子，可組成遺傳指令，以引導生物發(fā)育與生命機能運作。主要功能是長(cháng)期性的資訊儲存，可比喻為“藍圖”或“食譜”。其中包含的指令，是建構細胞內其他的化合物，如蛋白質(zhì)與RNA所需。帶有遺傳訊息的DNA片段稱(chēng)為基因，其他的DNA序列，有些直接以自身構造發(fā)揮作用，有些則參與調控遺傳訊息的表現。
單體脫氧核糖核酸聚合而成的聚合體——脫氧核糖核酸鏈，也被稱(chēng)為DNA。在繁殖過(guò)程中，父代把它們自己DNA的一部分（通常一半，即DNA雙鏈中的一條）復制傳遞到子代中，從而完成性狀的傳播。因此，化學(xué)物質(zhì)DNA會(huì )被稱(chēng)為“遺傳微?！?。原核細胞的擬核是一個(gè)長(cháng)DNA分子。真核細胞核中有不止一個(gè)染色體，每條染色體上含有一個(gè)或兩個(gè)DNA。不過(guò)它們一般都比原核細胞中的DNA分子大而且和蛋白質(zhì)結合在一起。DNA分子的功能是貯存決定物種性狀的幾乎所有蛋白質(zhì)和RNA分子的全部遺傳信息;編碼和設計生物有機體在一定的時(shí)空中有序地轉錄基因和表達蛋白完成定向發(fā)育的所有程序;初步確定了生物獨有的性狀和個(gè)性以及和環(huán)境相互作用時(shí)所有的應激反應.除染色體DNA外，有極少量結構不同的DNA存在于真核細胞的線(xiàn)粒體和葉綠體中。DNA病毒的遺傳物質(zhì)也是DNA,極少數為RNA.
DNA是一種長(cháng)鏈聚合物，組成單位稱(chēng)為核苷酸，而糖類(lèi)與磷酸分子借由酯鍵相連，組成其長(cháng)鏈骨架。每個(gè)糖分子都與四種堿基里的其中一種相接，這些堿基沿著(zhù)DNA長(cháng)鏈所排列而成的序列，可組成遺傳密碼，是蛋白質(zhì)氨基酸序列合成的依據。讀取密碼的過(guò)程稱(chēng)為轉錄，是根據DNA序列復制出一段稱(chēng)為RNA的核酸分子。多數RNA帶有合成蛋白質(zhì)的訊息，另有一些本身就擁有特殊功能，例如rRNA、snRNA與siRNA。
【四鏈體DNA】
Sundpuist和Klug在模擬1種原生動(dòng)物棘毛蟲(chóng)的端粒DNA時(shí),人工合成了1段DNA序列,發(fā)現在一定條件下模擬的富G單鏈DNA可形成四鏈體DNA結構。由此推測染色體端粒尾的單鏈之間也形成了四鏈體。Kang等人分別用實(shí)驗證實(shí)在晶體和溶液中，富G DNA也能夠形成四鏈體DNA結構。
四鏈體DNA的基本結構單位是G-四聯(lián)體，即在四聯(lián)體的中心有1個(gè)由4個(gè)帶負電荷的羧基氧原子圍成的“口袋”通過(guò)G-四聯(lián)體的堆積可以形成分子內或分子間的右手螺旋，與DNA雙螺旋結構比較，G-四聯(lián)體螺旋有2個(gè)顯著(zhù)的特點(diǎn)：1、它的穩定性決定于口袋內所結合的陽(yáng)離子種類(lèi)，已知k離子的結合使四聯(lián)體螺旋最穩定；2、它的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)都很穩定。
就目前對一些生物的DNA序列分析得知，富鳥(niǎo)嘌呤的DNA序列多見(jiàn)于一些在功能上及進(jìn)化上都相當保守的基因組區域，許多研究表明，富鳥(niǎo)嘌呤DNA鏈所形成的G-DNA可能是作為分子之間相互識別的元件之一，在生物體細胞中起著(zhù)一些特殊作用
【DNA的復制】
DNA是遺傳信息的載體，故親代DNA必須以自身分子為模板準確的復制成兩個(gè)拷貝，并分配到兩個(gè)子細胞中去，完成其遺傳信息載體的使命。而DNA的雙鏈結構對于維持這類(lèi)遺傳物質(zhì)的穩定性和復制的準確性都是極為重要的。
?。ㄒ唬〥NA的半保留復制
Waston和Click在提出DNA雙螺旋結構模型時(shí)曾就DNA復制過(guò)程進(jìn)行過(guò)研究，發(fā)現DNA在復制過(guò)程中堿基間的氫鍵首先斷裂（通過(guò)解旋酶），雙螺旋結構解旋分開(kāi)，每條鏈分別作模板合成新鏈。由于每個(gè)子代DNA的一條鏈來(lái)自親代，另一條則是新合成的，故稱(chēng)之為半保留式復制(semiconservative replication)。
?。ǘ〥NA復制過(guò)程
1．DNA雙螺旋的解旋
?。?）單鏈DNA結合蛋白（single—stranded DNA binding protein, ssbDNA蛋白）
?。?）DNA解鏈酶（DNA helicase）
?。?）DNA解鏈
2．岡崎片段與半不連續復制
3．復制的引發(fā)和終止
?。ㄈ┒肆：投肆Ｃ?
1941年美籍印度人麥克林托克（Mc Clintock）就提出了端粒(telomere)的假說(shuō)，認為染色體末端必然存在一種特殊結構——端?！，F在已知染色體端粒的作用至少有二：① 保護染色體末端免受損傷，使染色體保持穩定；② 與核纖層相連，使染色體得以定位。
【DNA的理化性質(zhì)】
DNA是大分子高分子聚合物，DNA溶液為高分子溶液，具有很高的粘度。DNA對紫外線(xiàn)有吸收作用，當核酸變性時(shí)，吸光值升高；當變性核酸可復性時(shí)，吸光值又會(huì )恢復到原來(lái)水平。溫度、有機溶劑、酸堿度、尿素、酰胺等試劑都可以引起DNA分子變性，即使得DNA雙鍵間的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開(kāi)。
DNA(deoxyribonucleic acid)指脫氧核糖核酸(染色體和基因的組成部分) 脫氧核苷酸的高聚物，是染色體的主要成分。遺傳信息的絕大部分貯存在DNA分子中。
【DNA的酶催化活性】
20世紀90年代，Cuenoud等發(fā)現DNA也有酶催化活性，他們根據共有序列設計并合成了由47個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA——E47，它可以催化兩個(gè)底物DNA片段之間的連接。DNA的雙功能性對“RNA世界”的進(jìn)化觀(guān)點(diǎn)提出了挑戰。
【分布和功能】
原核細胞的染色體是一個(gè)長(cháng)DNA分子。真核細胞核中有不止一個(gè)染色體，每個(gè)染色體也只含一個(gè)DNA分子。不過(guò)它們一般都比原核細胞中的DNA分子大而且和蛋白質(zhì)結合在一起。DNA分子的功能是貯存決定物種的所有蛋白質(zhì)和RNA結構的全部遺傳信息；策劃生物有次序地合成細胞和組織組分的時(shí)間和空間；確定生物生命周期自始至終的活性和確定生物的個(gè)性。除染色體DNA外，有極少量結構不同的DNA存在于真核細胞的線(xiàn)粒體和葉綠體中。DNA病毒的遺傳物質(zhì)也是DNA。
【DNA的發(fā)現】
自從孟德?tīng)柕倪z傳定律被重新發(fā)現以后，人們又提出了一個(gè)問(wèn)題：遺傳因子是不是一種物質(zhì)實(shí)體？為了解決基因是什么的問(wèn)題，人們開(kāi)始了對核酸和蛋白質(zhì)的研究。
遺傳學(xué)創(chuàng )始人孟德?tīng)栐缭?868年，人們就已經(jīng)發(fā)現了核酸。在德國化學(xué)家霍佩·賽勒的實(shí)驗室里，有一個(gè)瑞士籍的研究生名叫米歇爾（1844--1895），他對實(shí)驗室附近的一家醫院扔出的帶膿血的繃帶很感興趣，因為他知道膿血是那些為了保衛人體健康，與病菌“作戰”而戰死的白細胞和被殺死的人體細胞的“遺體”。于是他細心地把繃帶上的膿血收集起來(lái)，并用胃蛋白酶進(jìn)行分解，結果發(fā)現細胞遺體的大部分被分解了，但對細胞核不起作用。他進(jìn)一步對細胞核內物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現細胞核中含有一種富含磷和氮的物質(zhì)?；襞濉べ惱沼媒湍缸鰧?shí)驗，證明米歇爾對細胞核內物質(zhì)的發(fā)現是正確的。于是他便給這種從細胞核中分離出來(lái)的物質(zhì)取名為 “核素”，后來(lái)人們發(fā)現它呈酸性，因此改叫“核酸”。從此人們對核酸進(jìn)行了一系列卓有成效的研究。
20世紀初，德國科賽爾（1853--1927）和他的兩個(gè)學(xué)生瓊斯（1865--1935）和列文（1869－－1940）的研究，弄清了核酸的基本化學(xué)結構，認為它是由許多核苷酸組成的大分子。核苷酸是由堿基、核糖和磷酸構成的。其中堿基有4種（腺瞟吟、鳥(niǎo)嘌吟、胸腺嘧啶和胞嘧啶），核糖有兩種（核糖、脫氧核糖），因此把核酸分為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）。
列文急于發(fā)表他的研究成果，錯誤地認為4種堿基在核酸中的量是相等的，從而推導出核酸的基本結構是由4個(gè)含不同堿基的核苷酸連接成的四核苷酸，以此為基礎聚合成核酸，提出了"四核苷酸假說(shuō)"。這個(gè)錯誤的假說(shuō)，對認識復雜的核酸結構起了相當大的阻礙作用，也在一定程度上影響了人們對核酸功能的認識。人們認為，雖然核酸存在于重要的結構--細胞核中，但它的結構太簡(jiǎn)單，很難設想它能在遺傳過(guò)程中起什么作用。
美國遺傳學(xué)家摩爾根蛋白質(zhì)的發(fā)現比核酸早30年，發(fā)展迅速。進(jìn)入20世紀時(shí)，組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中已有12種被發(fā)現，到1940年則全部被發(fā)現。
1902年，德國化學(xué)家費歇爾提出氨基酸之間以肽鏈相連接而形成蛋白質(zhì)的理論，1917年他合成了由15個(gè)甘氨酸和3個(gè)亮氨酸組成的18個(gè)肽的長(cháng)鏈。于是，有的科學(xué)家設想，很可能是蛋白質(zhì)在遺傳中起主要作用。如果核酸參與遺傳作用，也必然是與蛋白質(zhì)連在一起的核蛋白在起作用。因此，那時(shí)生物界普遍傾向于認為蛋白質(zhì)是遺傳信息的載體。
1928年，美國科學(xué)家格里菲斯（1877--1941）用一種有莢膜、毒性強的和一種無(wú)莢膜、毒性弱的肺炎雙球菌對老鼠做實(shí)驗。他把有莢病菌用高溫殺死后與無(wú)莢的活病菌一起注人老鼠體內，結果他發(fā)現老鼠很快發(fā)病死亡，同時(shí)他從老鼠的血液中分離出了活的有莢病菌。這說(shuō)明無(wú)莢菌竟從死的有莢菌中獲得了什么物質(zhì)，使無(wú)莢菌轉化為有莢菌。這種假設是否正確呢？格里菲斯又在試管中做實(shí)驗，發(fā)現把死了的有美菌與活的無(wú)莢菌同時(shí)放在試管中培養，無(wú)莢菌全部變成了有莢菌，并發(fā)現使無(wú)莢菌長(cháng)出蛋白質(zhì)莢的就是已死的有莢菌殼中遺留的核酸（因為在加熱中，莢中的核酸并沒(méi)有被破壞）。格里菲斯稱(chēng)該核酸為"轉化因子"。
1944年，美國細菌學(xué)家艾弗里（1877--1955）從有美菌中分離得到活性的“轉化因子”，并對這種物質(zhì)做了檢驗蛋白質(zhì)是否存在的試驗，結果為陰性，并證明“轉化因子”是DNA。但這個(gè)發(fā)現沒(méi)有得到廣泛的承認，人們懷疑當時(shí)的技術(shù)不能除凈蛋白質(zhì)，殘留的蛋白質(zhì)起到轉化的作用。
美籍德國科學(xué)家德?tīng)柌紖慰耍?906--1981）的噬菌體小組對艾弗里的發(fā)現堅信不移。因為他們在電子顯微鏡下觀(guān)察到了噬菌體的形態(tài)和進(jìn)入大腸桿菌的生長(cháng)過(guò)程。噬菌體是以細菌細胞為寄主的一種病毒，個(gè)體微小，只有用電子顯微鏡才能看到它。它像一個(gè)小蝌蚪，外部是由蛋白質(zhì)組成的頭膜和尾鞘，頭的內部含有DNA，尾鞘上有尾絲、基片和小鉤。當噬菌體侵染大腸桿菌時(shí)，先把尾部末端扎在細菌的細胞膜上，然后將它體內的DNA全部注人到細菌細胞中去，蛋白質(zhì)空殼仍留在細菌細胞外面，再沒(méi)有起什么作用了。進(jìn)入細菌細胞后的噬菌體DNA，就利用細菌內的物質(zhì)迅速合成噬菌體的DNA和蛋白質(zhì)，從而復制出許多與原噬菌體大小形狀一模一樣的新噬菌體，直到細菌被徹底解體，這些噬菌體才離開(kāi)死了的細菌，再去侵染其他的細菌。
1952年，噬菌體小組主要成員赫爾希（1908一）和他的學(xué)生蔡斯用先進(jìn)的同位素標記技術(shù)，做噬菌體侵染大腸桿菌的實(shí)驗。他把大腸桿菌T2噬菌體的核酸標記上32P，蛋白質(zhì)外殼標記上35S。先用標記了的T2噬菌體感染大腸桿菌，然后加以分離，結果噬菌體將帶35S標記的空殼留在大腸桿菌外面，只有噬菌體內部帶有32P標記的核酸全部注人大腸桿菌，并在大腸桿菌內成功地進(jìn)行噬菌體的繁殖。這個(gè)實(shí)驗證明DNA有傳遞遺傳信息的功能，而蛋白質(zhì)則是由 DNA的指令合成的。這一結果立即為學(xué)術(shù)界所接受。
幾乎與此同時(shí)，奧地利生物化學(xué)家查加夫（1905--）對核酸中的4種堿基的含量的重新測定取得了成果。在艾弗里工作的影響下，他認為如果不同的生物種是由于DNA的不同，則DNA的結構必定十分復雜，否則難以適應生物界的多樣性。因此，他對列文的"四核苷酸假說(shuō)"產(chǎn)生了懷疑。在1948－ 1952年4年時(shí)間內，他利用了比列文時(shí)代更精確的紙層析法分離4種堿基，用紫外線(xiàn)吸收光譜做定量分析，經(jīng)過(guò)多次反復實(shí)驗，終于得出了不同于列文的結果。實(shí)驗結果表明，在DNA大分子中嘌吟和嘧啶的總分子數量相等，其中腺嘌吟A與胸腺嘧啶T數量相等，鳥(niǎo)嘌吟G與胞嘧啶C數量相等。說(shuō)明DNA分子中的堿基A 與T、G與C是配對存在的，從而否定了"四核苷酸假說(shuō)"，并為探索DNA分子結構提供了重要的線(xiàn)索和依據。
1953年4月25日，英國的《自然》雜志刊登了美國的沃森和英國的克里克在英國劍橋大學(xué)合作的研究成果：DNA雙螺旋結構的分子模型，這一成果后來(lái)被譽(yù)為20世紀以來(lái)生物學(xué)方面最偉大的發(fā)現，標志著(zhù)分子生物學(xué)的誕生。
沃森（1928一）在中學(xué)時(shí)代是一個(gè)極其聰明的孩子，15歲時(shí)便進(jìn)入芝加哥大學(xué)學(xué)習。當時(shí)，由于一個(gè)允許較早人學(xué)的實(shí)驗性教育計劃，使沃森有機會(huì )從各個(gè)方面完整地攻讀生物科學(xué)課程。在大學(xué)期間，沃森在遺傳學(xué)方面雖然很少有正規的訓練，但自從閱讀了薛定愕的《生命是什么？--活細胞的物理面貌》一書(shū)，促使他去"發(fā)現基因的秘密"。他善于集思廣益，博取眾長(cháng)，善于用他人的思想來(lái)充實(shí)自己。只要有便利的條件，不必強迫自己學(xué)習整個(gè)新領(lǐng)域，也能得到所需要的知識。沃森22歲取得博士學(xué)位，然后被送往歐洲攻讀博士后研究員。為了完全搞清楚一個(gè)病毒基因的化學(xué)結構，他到丹麥哥本哈根實(shí)驗室學(xué)習化學(xué)。有一次他與導師一起到意大利那不勒斯參加一次生物大分子會(huì )議，有機會(huì )聽(tīng)英國物理生物學(xué)家威爾金斯（1916--）的演講，看到了威爾金斯的DNAX射線(xiàn)衍射照片。從此，尋找解開(kāi)DNA結構的鑰匙的念頭在沃森的頭腦中索回。什么地方可以學(xué)習分析X射線(xiàn)衍射圖呢？于是他又到英國劍橋大學(xué)卡文迪什實(shí)驗室學(xué)習，在此期間沃森認識了克里克。
克里克（1916一2004）上中學(xué)時(shí)對科學(xué)充滿(mǎn)熱情，1937年畢業(yè)于倫敦大學(xué)。1946年，他閱讀了《生命是什么？－活細胞的物理面貌》一書(shū)，決心把物理學(xué)知識用于生物學(xué)的研究，從此對生物學(xué)產(chǎn)生了興趣。1947年他重新開(kāi)始了研究生的學(xué)習，1949年他同佩魯茲一起使用X射線(xiàn)技術(shù)研究蛋白質(zhì)分子結構，于是在此與沃森相遇了。當時(shí)克里克比沃森大12歲，還沒(méi)有取得博士學(xué)位。但他們談得很投機，沃森感到在這里居然能找到一位懂得DNA比蛋白質(zhì)更重要的人，真是三生有幸。同時(shí)沃森感到在他所接觸的人當中，克里克是最聰明的一個(gè)。他們每天交談至少幾個(gè)小時(shí)，討論學(xué)術(shù)問(wèn)題。兩個(gè)人互相補充，互相批評以及相互激發(fā)出對方的靈感。他們認為解決DNA分子結構是打開(kāi)遺傳之謎的關(guān)鍵。只有借助于精確的X射線(xiàn)衍射資料，才能更快地弄清DNA的結構。為了搞到DNAX射線(xiàn)衍射資料，克里克請威爾金斯到劍橋來(lái)度周末。在交談中威爾金斯接受了DNA結構是螺旋型的觀(guān)點(diǎn)，還談到他的合作者富蘭克林（1920一1958，女）以及實(shí)驗室的科學(xué)家們，也在苦苦思索著(zhù)DNA結構模型的問(wèn)題。從1951年11月至1953年4月的18個(gè)月中，沃森、克里克同威爾金斯、富蘭克林之間有過(guò)幾次重要的學(xué)術(shù)交往。
1951年11月，沃森聽(tīng)了富蘭克林關(guān)于DNA結構的較詳細的報告后，深受啟發(fā)，具有一定晶體結構分析知識的沃森和克里克認識到，要想很快建立 DNA結構模型，只能利用別人的分析數據。他們很快就提出了一個(gè)三股螺旋的DNA結構的設想。1951年底，他們請威爾金斯和富蘭克林來(lái)討論這個(gè)模型時(shí)，富蘭克林指出他們把DNA的含水量少算了一半，于是第一次設立的模型宣告失敗。
有一天，沃森又到國王學(xué)院威爾金斯實(shí)驗室，威爾金斯拿出一張富蘭克林最近拍制的“B型”DNA的X射線(xiàn)衍射的照片。沃森一看照片，立刻興奮起來(lái)、心跳也加快了，因為這種圖像比以前得到的“A型”簡(jiǎn)單得多，只要稍稍看一下“B型”的X射線(xiàn)衍射照片，再經(jīng)簡(jiǎn)單計算，就能確定DNA分子內多核苷酸鏈的數目了。
克里克請數學(xué)家幫助計算，結果表明源吟有吸引嘧啶的趨勢。他們根據這一結果和從查加夫處得到的核酸的兩個(gè)嘌吟和兩個(gè)嘧啶兩兩相等的結果，形成了堿基配對的概念。
他們苦苦地思索4種堿基的排列順序，一次又一次地在紙上畫(huà)堿基結構式，擺弄模型，一次次地提出假設，又一次次地推翻自己的假設。
沃森(左)和克里克有一次，沃森又在按著(zhù)自己的設想擺弄模型，他把堿基移來(lái)移去尋找各種配對的可能性。突然，他發(fā)現由兩個(gè)氫鍵連接的腺膘吟一胸腺嘧啶對竟然和由3個(gè)氫鍵連接的鳥(niǎo)嘌吟一胞嘧啶對有著(zhù)相同的形狀，于是精神為之大振。因為嘌吟的數目為什么和嘧啶數目完全相同這個(gè)謎就要被解開(kāi)了。查加夫規律也就一下子成了 DNA雙螺旋結構的必然結果。因此，一條鏈如何作為模板合成另一條互補堿基順序的鏈也就不難想象了。那么，兩條鏈的骨架一定是方向相反的。
經(jīng)過(guò)沃森和克里克緊張連續的工作，很快就完成了DNA金屬模型的組裝。從這模型中看到，DNA由兩條核苷酸鏈組成，它們沿著(zhù)中心軸以相反方向相互纏繞在一起，很像一座螺旋形的樓梯，兩側扶手是兩條多核苷酸鏈的糖一磷基因交替結合的骨架，而踏板就是堿基對。由于缺乏準確的X射線(xiàn)資料，他們還不敢斷定模型是完全正確的。
威爾金斯富蘭克林下一步的科學(xué)方法就是把根據這個(gè)模型預測出的衍射圖與X射線(xiàn)的實(shí)驗數據作一番認真的比較。他們又一次打電話(huà)請來(lái)了威爾金斯。不到兩天工夫，威爾金斯和富蘭克林就用X射線(xiàn)數據分析證實(shí)了雙螺旋結構模型是正確的，并寫(xiě)了兩篇實(shí)驗報告同時(shí)發(fā)表在英國《自然》雜志上。1962年，沃森、克里克和威爾金斯獲得了諾貝爾醫學(xué)和生理學(xué)獎，而富蘭克林因患癌癥于1958年病逝而未被授予該獎。
20世紀30年代后期，瑞典的科學(xué)家們就證明DNA是不對稱(chēng)的。第二次世界大戰后，用電子顯微鏡測定出DNA分子的直徑約為2nm。
DNA雙螺旋結構被發(fā)現后，極大地震動(dòng)了學(xué)術(shù)界，啟發(fā)了人們的思想。從此，人們立即以遺傳學(xué)為中心開(kāi)展了大量的分子生物學(xué)的研究。首先是圍繞著(zhù)4 種堿基怎樣排列組合進(jìn)行編碼才能表達出20種氨基酸為中心開(kāi)展實(shí)驗研究。1967年，遺傳密碼全部被破解，基因從而在DNA分子水平上得到新的概念。它表明：基因實(shí)際上就是DNA大分子中的一個(gè)片段，是控制生物性狀的遺傳物質(zhì)的功能單位和結構單位。在這個(gè)單位片段上的許多核苷酸不是任意排列的，而是以有含意的密碼順序排列的。一定結構的DNA，可以控制合成相應結構的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)是組成生物體的重要成分，生物體的性狀主要是通過(guò)蛋白質(zhì)來(lái)體現的。因此，基因對性狀的控制是通過(guò)DNA控制蛋白質(zhì)的合成來(lái)實(shí)現的。在此基礎上相繼產(chǎn)生了基因工程、酶工程、發(fā)酵工程、蛋白質(zhì)工程等，這些生物技術(shù)的發(fā)展必將使人們利用生物規律造福于人類(lèi)?，F代生物學(xué)的發(fā)展，愈來(lái)愈顯示出它將要上升為帶頭學(xué)科的趨勢。
【DNA重組技術(shù)的發(fā)展】
20世紀50年代，DNA雙螺旋結構被闡明，揭開(kāi)了生命科學(xué)的新篇章，開(kāi)創(chuàng )了科學(xué)技術(shù)的新時(shí)代。隨后，遺傳的分子機理――DNA復制、遺傳密碼、遺傳信息傳遞的中心法則、作為遺傳的基本單位和細胞工程藍圖的基因以及基因表達的調控相繼被認識。至此，人們已完全認識到掌握所有生物命運的東西就是DNA和它所包含的基因，生物的進(jìn)化過(guò)程和生命過(guò)程的不同，就是因為DNA和基因運作軌跡不同所致。
知道DNA的重大作用和價(jià)值后，生命科學(xué)家首先想到能否在某些與人類(lèi)利益密切相關(guān)的方面打破自然遺傳的鐵律，讓患病者的基因改邪歸正以達治病目的，把不同來(lái)源的基因片段進(jìn)行“嫁接”以產(chǎn)生新品種和新品質(zhì)……于是，一個(gè)充滿(mǎn)了誘惑力的科學(xué)幻想奇跡般地成為現實(shí)。這是發(fā)生在20世紀70年代初的事情。
實(shí)現這一科學(xué)奇跡的科技手段就是DNA重組技術(shù)。1972年，美國科學(xué)家保羅?伯格首次成功地重組了世界上第一批DNA分子，標志著(zhù)DNA重組技術(shù)――基因工程作為現代生物工程的基礎，成為現代生物技術(shù)和生命科學(xué)的基礎與核心
DNA重組技術(shù)的具體內容就是采用人工手段將不同來(lái)源的含某種特定基因的DNA片段進(jìn)行重組，以達到改變生物基因類(lèi)型和獲得特定基因產(chǎn)物的目的的一種高科學(xué)技術(shù)。
到了20世紀70年代中后期，由于出現了工程菌以及實(shí)現DNA重組和后處理都有工程化的性質(zhì)，基因工程或遺傳工程作為DNA重組技術(shù)的代名詞被廣泛使用?，F在，基因工程還包括基因組的改造、核酸序列分析、分子進(jìn)化分析、分子免疫學(xué)、基因克隆、基因診斷和基因治療等內容?？梢哉f(shuō)，DNA重組技術(shù)創(chuàng )立近 30多年來(lái)所獲得的豐碩成果已經(jīng)把人們帶進(jìn)了一個(gè)不可思議的夢(mèng)幻般的科學(xué)世界，使人類(lèi)獲得了打開(kāi)生命奧秘和防病治病“魔盒”的金鑰匙。
目前，DNA重組技術(shù)已經(jīng)取得的成果是多方面的。到20世紀末，DNA重組技術(shù)最大的應用領(lǐng)域在醫藥方面，包括活性多肽、蛋白質(zhì)和疫苗的生產(chǎn)，疾病發(fā)生機理、診斷和治療，新基因的分離以及環(huán)境監測與凈化。
許多活性多肽和蛋白質(zhì)都具有治療和預防疾病的作用，它們都是從相應的基因中產(chǎn)生的。但是由于在組織細胞內產(chǎn)量極微，所以采用常規方法很難獲得足夠量供臨床應用。
基因工程則突破了這一局限性，能夠大量生產(chǎn)這類(lèi)多肽和蛋白質(zhì)，迄今已成功地生產(chǎn)出治療糖尿病和精神分裂癥的胰島素，對血癌和某些實(shí)體腫瘤有療效的抗病毒劑――干擾素，治療侏儒癥的人體生長(cháng)激素，治療肢端肥大癥和急性胰腺炎的生長(cháng)激素釋放抑制因子等100多種產(chǎn)品。
基因工程還可將有關(guān)抗原的DNA導入活的微生物，這種微生物在受免疫應激后的宿主體內生長(cháng)可產(chǎn)生弱毒活疫苗，具有抗原刺激劑量大、且持續時(shí)間長(cháng)等優(yōu)點(diǎn)。目前正在研制的基因工程疫苗就有數十種之多，在對付細菌方面有針對麻風(fēng)桿菌、百日咳桿菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌等的疫苗；在對付病毒方面有針對甲型肝炎、乙型肝炎、巨細胞病毒、單純皰疹、流感、人體免疫缺陷病毒等的疫苗……。我國乙肝病毒攜帶者和乙肝患者多達一二億，這一情況更促使了我國科學(xué)家自行成功研制出乙肝疫苗，取得了巨大的社會(huì )效益和經(jīng)濟效益。
抗體是人體免疫系統防病抗病的主要武器之一，20世紀70年代創(chuàng )立的單克隆抗體技術(shù)在防病抗病方面雖然發(fā)揮了重要作用，但由于人源性單抗很難獲得，使得單抗在臨床上的應用受到限制。為解決此問(wèn)題，近年來(lái)科學(xué)家采用DNA重組技術(shù)已獲得了人源性抗體，這種抗體既可保證它與抗原結合的專(zhuān)一性和親合力，又能保證正常功能的發(fā)揮。目前，已有多種這樣的抗體進(jìn)行了臨床試驗，如抗HER-2人源化單抗治療乳腺癌已進(jìn)入Ⅲ期試驗，抗IGE人源化單抗治療哮喘病已進(jìn)入Ⅱ期試驗。
抗生素在治療疾病上起到了重要作用，隨著(zhù)抗生素數量的增加，用傳統方法發(fā)現新抗生素的幾率越來(lái)越低。為了獲取更多的新型抗生素，采用DNA重組技術(shù)已成為重要手段之一。目前人們已獲得數十種基因工程“雜合”的抗生素，為臨床應用開(kāi)辟了新的治療途徑。
值得指出的是，以上所述基因工程多肽、蛋白質(zhì)、疫苗、抗生素等防治藥物不僅在有效控制疾病，而且在避免毒副作用方面也往往優(yōu)于以傳統方法生產(chǎn)的同類(lèi)藥品，因而更受人們青睞。
人類(lèi)疾病都直接或間接與基因相關(guān)，在基因水平上對疾病進(jìn)行診斷和治療，則既可達到病因診斷的準確性和原始性，又可使診斷和治療工作達到特異性強、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速的目的。于基因水平進(jìn)行診斷和治療在專(zhuān)業(yè)上稱(chēng)為基因診斷和基因治療。目前基因診斷作為第四代臨床診斷技術(shù)已被廣泛應用于對遺傳病、腫瘤、心腦血管疾病、病毒細菌寄生蟲(chóng)病和職業(yè)病等的診斷；而基因治療的目標則是通過(guò)DNA重組技術(shù)創(chuàng )建具有特定功能的基因重組體，以補償失去功能的基因的作用，或是增加某種功能以利對異常細胞進(jìn)行矯正或消滅。
在理論上，基因治療是治本治愈而無(wú)任何毒副作用的療法。不過(guò)，盡管至今國際上已有100多個(gè)基因治療方案正處于臨床試驗階段，但基因治療在理論和技術(shù)上的一些難題仍使這種治療方法離大規模應用還有一段很長(cháng)的距離。不論是確定基因病因還是實(shí)施基因診斷、基因治療、研究疾病發(fā)生機理，關(guān)鍵的先決條件是要了解特定疾病的相關(guān)基因。隨著(zhù)“人類(lèi)基因組計劃”的臨近完成，科學(xué)家們對人體全部基因將會(huì )獲得全面的了解，這就為運用基因重組技術(shù)造逼于人類(lèi)健康事業(yè)創(chuàng )造了條件。
不過(guò)，雖然基因技術(shù)向人類(lèi)展示了它奇妙的“魔術(shù)師”般的魅力，但也有大量的科學(xué)家對這種技術(shù)的發(fā)展予以人類(lèi)倫理和生態(tài)演化的自然法則的沖擊表示出極大的擔憂(yōu)。從理論上來(lái)講，這種技術(shù)發(fā)展的一個(gè)極致就是使人類(lèi)擁有了創(chuàng )造任何生命形態(tài)或從未有過(guò)的生物的能力。人們能夠想像這將是怎樣的結果嗎?
科學(xué)家在DNA中發(fā)現除基因密碼之外的新密碼
據臺灣媒體報道，美國與以色列科學(xué)家相信，他們已在DNA(去氧核醣核酸)之中找到除了基因密碼之外的第二種密碼。新發(fā)現的密碼負責決定核體─亦即DNA所環(huán)繞的微型蛋白質(zhì)線(xiàn)軸─之位置。這些線(xiàn)軸同時(shí)保護與控制通往DNA本身的途徑。
這項發(fā)現若獲得證實(shí)，可能開(kāi)啟有關(guān)控制基因更高位階的機制新知。譬如，每一種人體細胞得以激活其所需基因，卻又無(wú)法觸及其它種類(lèi)細胞所使用的基因等既關(guān)鍵又神秘的過(guò)程。
以色列魏茲曼研究院的塞格爾與美國西北大學(xué)的威頓及其同僚，在這一期“自然”科學(xué)期刊中，撰文描述這種DNA新密碼。
每一個(gè)人體細胞里都有約三千萬(wàn)個(gè)核體。之所以需要這么多的核體，是因為DNA線(xiàn)包覆每一個(gè)核體僅一.六五次，每個(gè)DNA螺旋就包含一百四十七個(gè)單位，而且單一染色體里的DNA分子在長(cháng)度上可能就有高達二億二千五百萬(wàn)個(gè)單位。
生物學(xué)家多年來(lái)一直懷疑，DNA上的某些位置，特別是DNA最容易彎曲的那些位置，可能比其它位置更有利于核體的存在，但整體模式并不顯而易見(jiàn)。如今，塞格爾與威頓博士分析了酵母菌基因內約二百個(gè)位置的序列，這些都是既知核體糾結在一起的地方，兩人發(fā)現其中確實(shí)隱含一個(gè)模式存在。
透過(guò)了解此一模式，他們成功預測其它有機體大約五成核體的位置。這個(gè)模式乃是能讓DNA更容易彎曲，以及緊密包復核體的兩種序列結合而成。但在此一模式中，每一個(gè)核體糾結的位置僅需若干序列出現即可，因此并不明顯。正由于其形成條件松散，因此并不與基因密碼沖突。
【DNA親子鑒定】
鑒定親子關(guān)系目前用得最多的是DNA分型鑒定。人的血液、毛發(fā)、唾液、口腔細胞等都可以用于用親子鑒定，十分方便。 一個(gè)人有23對（46條）染色體，同一對染色體同一位置上的一對基因稱(chēng)為等位基因，一般一個(gè)來(lái)自父親，一個(gè)來(lái)自母親。如果檢測到某個(gè)DNA位點(diǎn)的等位基因，一個(gè)與母親相同，另一個(gè)就應與父親相同，否則就存在疑問(wèn)了。
利用DNA進(jìn)行親子鑒定，只要作十幾至幾十個(gè)DNA位點(diǎn)作檢測，如果全部一樣，就可以確定親子關(guān)系，如果有3個(gè)以上的位點(diǎn)不同，則可排除親子關(guān)系，有一兩個(gè)位點(diǎn)不同，則應考慮基因突變的可能，加做一些位點(diǎn)的檢測進(jìn)行辨別。DNA親子鑒定，否定親子關(guān)系的準確率幾近100%，肯定親子關(guān)系的準確率可達到99.99%。
DNA親子鑒定測試的常見(jiàn)問(wèn)題
什么是DNA親子鑒定測試?
DNA(脫氧核糖核酸)是人身體內細胞的原子物質(zhì)。 每個(gè)原子有46個(gè)染色體,另外,男性的精子細胞和女性的卵子, 各有23個(gè)染色體,當精子和卵子結合的時(shí)候。這46個(gè)原子染色體就制造一個(gè)生命, 因此,每人從生父處繼承一半的分子物質(zhì), 而另一半則從生母處獲得。
DNA親子鑒定測試與傳統的血液測試有很大的不同。 它可以在不同的樣本上進(jìn)行測試, 包括血液,腮腔細胞, 組織細胞樣本和精液樣本。 由于血液型號, 例如A型, B型, O型或RH型, 在人群中的運用比較普遍, 用來(lái)分辨每一個(gè)人的血緣關(guān)系, 但不如DNA親子鑒定測試有效。除了真正雙胞胎外, 每人的DNA是獨一無(wú)二的. 由于它是這樣獨特, 就好像指紋一樣, 用于親子鑒定, DNA是最為有效的方法。我們的結果通常是比法庭上要求的還準確10到100倍。
親子鑒定的準確性
DNA親子鑒定是目前最準確的親權鑒定方法，如果小孩的遺傳位點(diǎn)和被測試男子的位點(diǎn)（至少1個(gè)）不一致，那么該男子便100％被排除血緣關(guān)系之外，即他絕對不可能是孩子的父親。如果孩子與其父母親的位點(diǎn)都吻合，我們就能得出親權關(guān)系大于99．99％的可能性，即證明他們之間的血緣親子關(guān)系。
親子鑒定須知（1） 被鑒定人應由母－子－可疑父親或父母－子組成，只要求父子或母子二人鑒定者一般不予受理；（2） 成年被鑒定人均應自愿同意鑒定，12歲以上的青少年應適當求其對鑒定的意見(jiàn)；（3） 被鑒定人應了解自己或近親屬有無(wú)遺傳病史；（4） 被鑒定子女年齡一般在半歲以上為好；（5） 羊水或絨毛作親子鑒定應孕婦及可疑父親簽定委托鑒定協(xié)議書(shū)。
【DNA超速離心】
近代質(zhì)粒DNA分離純化以從大腸桿菌中分離為代表，鑒于大局桿菌（E.coli）在分子生物學(xué)研究中的重要地位，從E.coli中分離純化質(zhì)控DNA〈Piasmid DNA〉成為近年來(lái)超離心技術(shù)中一個(gè)重要課題。而質(zhì)粒DNA的快速分離純化又對超離心設備（超速離心機、轉頭和附屬設備）提出了更高要求。
E.coli是典型的原核細胞生物，由于原核細胞缺乏其核細胞所具有的那種由單位膜組成的可把多種功能組分分隔為專(zhuān)一化的和局部獨立區域的內膜系統，因而沒(méi)有其核細胞所包含的細胞器（核、內質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線(xiàn)拉體、溶酶體等等）。電鏡顯微照片顯示E.coli有兩個(gè)可以區別的內部區域一一細胞質(zhì)和核質(zhì)，在它們外面圍著(zhù)一層較薄的細胞質(zhì)膜和很厚的細胞壁，在細胞壁外部附著(zhù)一些一端游離的鞭毛。質(zhì)粒DNA位于核區，以細絲狀存在，這種細絲狀物在多種情況下是極長(cháng)的環(huán)狀DNA的一些片斷所折疊起來(lái)的聚密體。
針對E.coli的顯微結構待點(diǎn)，在進(jìn)行超離心分離純化質(zhì)粒DNA之前的預處理順序是：
E.coli→用溶菌酶去細胞壁→用表面活性劑如SDS、Trit X-100等EE細胞膜→用乙酸鍋使DNA、RNA及蛋白質(zhì)大部分沉淀(90%以上)。
沉淀物可以在加入TE緩沖液(10m-MTris-HCL lmMEDTA,pH8.0)后分子篩上住去蛋白,去RNA;也可以用超速離心法去蛋白質(zhì),去RNA，去級狀DNA或DNA斷片。
【質(zhì)粒DNA超速離心的分離方法】
傳統的分離方法：數年前，由于受設備條件限制，質(zhì)粒DNA的分離一般用CsCl平衡等密度離心法，自形成梯度。以10~12ml單管容量為例，用甩平轉頭分離，36.000rpm×60小時(shí)，用角式轉頭分離45,OOOrpm×36小時(shí)，前者包括加減速在內共用去1.3億轉驅動(dòng)部壽命，后者也要用去1億轉驅動(dòng)部壽命，這對當時(shí)超速離心機總壽命為100~200億轉來(lái)看，無(wú)疑每次實(shí)驗費用過(guò)高，加上CsCl用量多、價(jià)格貴等因素，使這類(lèi)分離純化工作成為非常昂貴的實(shí)驗。
?。?）超速垂直管轉頭的離心分離（欽合金或碳纖維制造的）：從1975年垂直管轉頭向世后，近年來(lái)各主要離心機生產(chǎn)商開(kāi)發(fā)的垂直管轉頭，單管容量0.2ml到4Oml，最高轉速從50,000rpm到120,000rpm,RCFmax可達700,OOOXg，90年代開(kāi)發(fā)的新機型和轉頭己能夠使質(zhì)粒DNA垂直管離心分離實(shí)驗做起來(lái)得心應手。
?。?）近垂直管轉頭離心分離：為了消除垂直管轉頭用于質(zhì)粒DNA離心在壁部形成的RNA沉淀對已形成的DNA區帶的污染，同時(shí)也為了改進(jìn)一般斜角式轉頭（傾角25?——35?）由于沉降距離較長(cháng)，因而分離時(shí)間也較長(cháng)的缺點(diǎn)，近幾年開(kāi)發(fā)了多種近垂直管轉頭（即Near VerticalTube Rot時(shí),簡(jiǎn)稱(chēng)NVT轉頭或Neo Angle Rotor,小假角轉頭,簡(jiǎn)稱(chēng)NT).它們的離心管縱剖面中心軸線(xiàn)與離心機驅動(dòng)軸線(xiàn)之間夾角在7.5?——10?之間,轉速從65,000rpm到120,OOOrpm，RCFmax可達646,000×g單管容量從2ml至13.5ml。NVT（或NT）轉頭的開(kāi)發(fā)主要是為質(zhì)粒DNA分離而設計，當然它也適用于線(xiàn)粒體DNA、染色體DNA、RNA及血清脂蛋白的分離?純化。
?。?）不連續階梯梯度分離:質(zhì)校DNA分離純化傳統方法是采用金管CsCl自形成梯度平衡等密度離心法，離心開(kāi)始時(shí)金管CsCl密度均一，樣品均勻分布其中。
【人類(lèi)基因組計劃】
人類(lèi)基因組計劃(human genome project, HGP)是由美國科學(xué)家于1985年率先提出，于1990年正式啟動(dòng)的。美國、英國、法蘭西共和國、德意志聯(lián)邦共和國、日本國和我國科學(xué)家共同參與了這一價(jià)值達30億美元的人類(lèi)基因組計劃。這一計劃旨在為30多億個(gè)堿基對構成的人類(lèi)基因組精確測序，發(fā)現所有人類(lèi)基因并搞清其在染色體上的位置，破譯人類(lèi)全部遺傳信息。與曼哈頓原子彈計劃和阿波羅登月計劃并稱(chēng)為三大科學(xué)計劃。
2000年6月26日，參加人類(lèi)基因組工程項目的美國、英國、法蘭西共和國、德意志聯(lián)邦共和國、日本國國和中國的6國科學(xué)家共同宣布，人類(lèi)基因組草圖的繪制工作已經(jīng)完成。最終完成圖要求測序所用的克隆能忠實(shí)地代表常染色體的基因組結構，序列錯誤率低于萬(wàn)分之一。 95%常染色質(zhì)區域被測序，每個(gè)Gap小于150kb。完成圖將于2003年完成，比預計提前2年。
美國和英國科學(xué)家2006年5月18日在英國《自然》雜志網(wǎng)絡(luò )版上發(fā)表了人類(lèi)最后一個(gè)染色體——1號染色體的基因測序。
在人體全部22對常染色體中，1號染色體包含基因數量最多，達3141個(gè)，是平均水平的兩倍，共有超過(guò)2.23億個(gè)堿基對，破譯難度也最大。一個(gè)由150名英國和美國科學(xué)家組成的團隊歷時(shí)10年，才完成了1號染色體的測序工作。
科學(xué)家不止一次宣布人類(lèi)基因組計劃完工，但推出的均不是全本，這一次殺青的“生命之書(shū)”更為精確，覆蓋了人類(lèi)基因組的99．99％。解讀人體基因密碼的“生命之書(shū)”宣告完成，歷時(shí)16年的人類(lèi)基因組計劃書(shū)寫(xiě)完了最后一個(gè)章節。
【“垃圾DNA”】
酵母和蠕蟲(chóng)之類(lèi)的簡(jiǎn)單生物是如何進(jìn)化為鳥(niǎo)和哺乳動(dòng)物這樣的復雜生物的呢？一項針對基因組進(jìn)行的廣泛比較研究顯示，問(wèn)題的答案可能就隱藏在生物的垃圾脫氧核糖核酸（DNA）中。美國科學(xué)家發(fā)現，生物越復雜，其攜帶的垃圾DNA就越多，而恰恰是這些沒(méi)有編碼的“無(wú)用”DNA幫助高等生物進(jìn)化出了復雜的機體。
自從第一個(gè)真核生物——包括從酵母到人類(lèi)的有細胞核的生物——的基因組被破譯以來(lái)，科學(xué)家一直想知道，為什么生物的大多數DNA并沒(méi)有形成有用的基因。從突變保護到染色體的結構支撐，對于這種所謂的垃圾DNA的可能解釋有許多種。但是去年從人類(lèi)、小鼠和大鼠身上得到的完全一致的關(guān)于垃圾DNA的研究結果卻表明，在這一區域中可能包含有重要的調節機制，從而能夠控制基礎的生物化學(xué)反應和發(fā)育進(jìn)程，這將幫助生物進(jìn)化出更為復雜的機體。與簡(jiǎn)單的真核生物相比，復雜生物有更多的基因不會(huì )發(fā)生突變的事實(shí)無(wú)疑極大地強化了這一發(fā)現。
為了對這一問(wèn)題有更深的了解，由美國加利福尼亞大學(xué)圣塔克魯斯分校(UCSC)的計算生物學(xué)家David Haussler領(lǐng)導的一個(gè)研究小組，對5種脊椎動(dòng)物——人、小鼠、大鼠、雞和河豚——的垃圾DNA序列與4種昆蟲(chóng)、兩種蠕蟲(chóng)和7種酵母的垃圾DNA序列進(jìn)行了比較。研究人員從對比結果中得到了一個(gè)驚人的模式：生物越復雜，垃圾DNA似乎就越重要。
這其中暗含的可能性在于，如果不同種類(lèi)的生物具有相同的DNA，那么這些DNA必定是用來(lái)解決一些關(guān)鍵性的問(wèn)題的。酵母與脊椎動(dòng)物共享了一定數量的DNA，畢竟它們都需要制造蛋白質(zhì)，但是只有15%的共有DNA與基因無(wú)關(guān)。研究小組在7月14日的《基因組研究》雜志網(wǎng)絡(luò )版上報告說(shuō)，他們將酵母與更為復雜的蠕蟲(chóng)進(jìn)行了比較，后者是一種多細胞生物，發(fā)現有40%的共有DNA沒(méi)有被編碼。隨后，研究人員又將脊椎動(dòng)物與昆蟲(chóng)進(jìn)行了對比，這些生物比蠕蟲(chóng)更為復雜，結果發(fā)現，有超過(guò)66%的共有DNA包含有沒(méi)有編碼的DNA。
參與該項研究工作的UCSC計算生物學(xué)家Adam Siepel指出，有關(guān)蠕蟲(chóng)的研究結果需要慎重對待，這是由于科學(xué)家僅僅對其中的兩個(gè)基因組進(jìn)行了分析。盡管如此，Siepel還是認為，這一發(fā)現有力地支持了這樣一種理論，即脊椎動(dòng)物和昆蟲(chóng)的生物復雜性的增加主要是由于基因調節的精細模式。
【DNA探針】
DNA探針是最常用的核酸探針，指長(cháng)度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針?，F已獲得DNA探針數量很多，有細菌、病毒、原蟲(chóng)、真菌、動(dòng)物和人類(lèi)細胞DNA探針。這類(lèi)探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細菌的毒力因子基因探針和人類(lèi)Alu探針。這些DNA探針的獲得有賴(lài)于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應用。以細菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細菌的分類(lèi)和菌種鑒定比之G+C百分比值要準確的多，是細菌分類(lèi)學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。細菌的基因組大小約5×106bp，約含3000個(gè)基因。各種細菌之間絕大部分DNA是相同的，要獲得某細菌特異的核酸探針，通常要采取建立細菌基因組DNA文庫的辦法，即將細菌DNA切成小片段后分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫。然后用多種其它菌種的DNA作探針來(lái)篩選，產(chǎn)生雜交信號的克隆被剔除，最后剩下的不與任何其它細菌雜交的克隆則可能含有該細菌特異性DNA片段。將此重組質(zhì)粒標記后作探針進(jìn)一步鑒定，亦可經(jīng)DNA序列分析鑒定其基因來(lái)源和功能。因此要得到一種特異性DNA探針，常常是比較繁瑣的。探針DNA克隆的篩選也可采用血清學(xué)方法，所不同的是所建DNA文庫為可表達性，克隆菌落或噬斑經(jīng)裂解后釋放出表達抗原，然后用來(lái)源細菌的多克隆抗血清篩選陽(yáng)性克隆，所得到多個(gè)陽(yáng)性克隆再經(jīng)其它細菌的抗血清篩選，最后只與本細菌抗血清反應的表達克隆即含有此細菌的特異性基因片段，它所編碼的蛋白是該菌種所特有的。用這種表達文庫篩選得到的顯然只是特定基因探針。
【DNA修復】
DNA修復（DNA repairing）是細胞對DNA受損傷后的一種反應，這種反應可能使DNA結構恢復原樣，重新能執行它原來(lái)的功能；但有時(shí)并非能完全消除DNA的損傷，只是使細胞能夠耐受這DNA的損傷而能繼續生存。也許這未能完全修復而存留下來(lái)的損傷會(huì )在適合的條件下顯示出來(lái)（如細胞的癌變等），但如果細胞不具備這修復功能，就無(wú)法對付經(jīng)常在發(fā)生的DNA損傷事件，就不能生存。所以研究DNA修復也是探索生命的一個(gè)重要方面，而且與軍事醫學(xué)、腫瘤學(xué)等密切相關(guān)。對不同的DNA損傷，細胞可以有不同的修復反應。
DNA含有A、C、G、T四種堿基，通常情況下A——T，C——G組合堿基對構成DNA鏈的橫檔?；蚓褪峭ㄟ^(guò)解讀DNA中這些堿基排列順序來(lái)傳達給細胞指令，控制細胞工作。
很多因素會(huì )引起DNA鏈斷裂，DNA鏈在重組中堿基要重新排列，導致基因解讀的堿基排列和原來(lái)不同，發(fā)出錯誤指令，造成細胞錯誤的生長(cháng)及工作狀態(tài)，因此發(fā)生了細胞變異，也就會(huì )產(chǎn)生了腫瘤細胞。腫瘤細胞會(huì )吸收大量的人體養份或正常細胞而快速成長(cháng)，因此腫瘤細胞比正常細胞要大的多，細胞核比正常大1-5倍，并且多發(fā)生畸形等情況。同時(shí)腫瘤DNA鏈在同樣的情況也會(huì )發(fā)生斷裂，因為DNA具有自身修復和半保留復制的功能，DNA連接酶可將DNA片段再次連接起來(lái)，在旋轉酶的作用下重新形成螺旋狀。并且一小段DNA就可遺傳腫瘤細胞的特性生成新的腫瘤細胞?，F在科學(xué)家常常提到的克隆，就是利用了DNA的這一特性。所以大部分情況下腫瘤DNA鏈的重組是一變二或一變多的過(guò)程，這就形成腫瘤細胞的復制和繁殖，由此就造成腫瘤的擴大、擴散、轉移及惡化，最終威脅人類(lèi)的健康和生命。
【單鏈DNA】
單鏈DNA（single－stranded DNA）大部分DNA以雙螺旋結構存在，但一經(jīng)熱或堿處理就會(huì )變?yōu)閱捂湢顟B(tài)。單鏈DNA就是指以這種狀態(tài)存在的DNA。單鏈DNA在分子流體力學(xué)性質(zhì)、吸收光譜、堿基反應性質(zhì)等方面都和雙鏈DNA不同。某些噬菌體粒子內含有單鏈環(huán)狀的DNA，這樣的噬菌體DNA在細胞內增殖時(shí)則形成雙鏈DNA。
【閉環(huán)DNA】
閉環(huán)DNA（closed circular DNA）沒(méi)有斷口的雙鏈環(huán)狀DNA，亦稱(chēng)為超螺旋DNA。由于具有螺旋結構的雙鏈各自閉合，結果使整個(gè)DNA分子進(jìn)一步旋曲而形成三級結構。另外如果一條或二條鏈的不同部位上產(chǎn)生一個(gè)斷口，就會(huì )成為無(wú)旋曲的開(kāi)環(huán)DNA分子。從細胞中提取出來(lái)的質(zhì)?；虿《綝NA都含有閉環(huán)和開(kāi)環(huán)這二種分子?？筛鶕烧吲c色素結合能力的不同，而將兩者分離開(kāi)來(lái)。
【連接DNA】
連接DNA (Linker DNA)：核小體中除146bp核心DNA 外的所有DNA。
【模板DNA】
模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線(xiàn)狀分子,也可以是環(huán)狀分子(線(xiàn)狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好).就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數量和純度。
【互補DNA】
互補DNA（cDNA, complementary DNA ）構成基因的雙鏈DNA分子用一條單鏈作為模板，轉錄產(chǎn)生與其序列互補的信使RNA分子,然后在反轉錄酶的作用下,以mRNA分子為模板,合成一條與mRNA序列互補的單鏈DNA,最后再以單鏈DNA為模板合成另一條與其互補的單鏈DNA,兩條互補的單鏈DNA分子組成一個(gè)雙鏈cDNA分子.因此,雙鏈cDNA分子的序列同轉錄產(chǎn)生的mRNA分子的基因是相同的.所以一個(gè)cDNA分子就代表一個(gè)基因.但是cDNA仍不同于基因,因為基因在轉錄產(chǎn)生mRNA時(shí),一些不編碼的序列即內含子被刪除了,保留的只是編碼序列,即外顯子.所以cDNA序列都比基因序列要短得多,因為cDNA中不包括基因的非編碼序列---內含子。
【DNA限制性片斷長(cháng)度多態(tài)性分析】
在人類(lèi)基因組中，平均約200對堿基可發(fā)生一對變異（稱(chēng)為中性突變），中性突變導致個(gè)體間核苷酸序列的差異，稱(chēng)為DNA多態(tài)性。不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性?xún)惹忻缸R別位點(diǎn)上，酶解該DNA片段就會(huì )產(chǎn)生長(cháng)度不同的片斷，稱(chēng)為限制性片段長(cháng)度多態(tài)性(RFLP)。RFLR按孟德?tīng)柗绞竭z傳，在某一特定家族中，如果某一致病基因與特異的多態(tài)性片斷緊密連鎖，就可用這一多態(tài)性片段為一種“遺傳標志”，來(lái)判斷家庭成員或胎兒是否為致病基因的攜帶者。甲型血友病、囊性纖維病變和苯丙酮尿癥等均可借助這一方法得到診斷。
核酸分解的第一步是水解核苷酸之間的磷酸二酯鍵，在高等動(dòng)植物中都有作用于磷酸二酯鍵的核酸酶。不同來(lái)源的核酸酶，其專(zhuān)一性、作用方式都有所不同。有些核酸酶只能作用于RNA，稱(chēng)為核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于DNA，稱(chēng)為脫氧核糖核酸酶（DNase），有些核酸酶專(zhuān)一性較低，既能作用于RNA也能作用于DNA，因此統稱(chēng)為核酸酶（nuclease）。根據核酸酶作用的位置不同，又可將核酸酶分為核酸外切酶（exonuclease）和核酸內切酶（endonuclease）。
一、核酸外切酶
有些核酸酶能從DNA或RNA鏈的一端逐個(gè)水解下單核苷酸，所以稱(chēng)為核酸外切酶。只作用于DNA的核酸外切酶稱(chēng)為脫氧核糖核酸外切酶，只作用于RNA的核酸外切酶稱(chēng)為核糖核酸外切酶；也有一些核酸外切酶可以作用于DNA或RNA。核酸外切酶從3′端開(kāi)始逐個(gè)水解核苷酸，稱(chēng)為3′→5′外切酶，例如，蛇毒磷酸二酯酶即是一種3′→5′外切酶，水解產(chǎn)物為5′核苷酸；核酸外切酶從5′端開(kāi)始逐個(gè)水解核苷酸，稱(chēng)為5′→3′外切酶，例如：牛脾磷酸二酯酶即是一種5′→3′外切酶，水解產(chǎn)物為3′核苷酸。
二、核酸內切酶
核酸內切酶催化水解多核苷酸內部的磷酸二酯鍵。有些核酸內切酶僅水解5′磷酸二酯鍵，把磷酸基團留在3′位置上，稱(chēng)為5′-內切酶；而有些僅水解3′-磷酸二酯鍵，把磷酸基團留在5′位置上，稱(chēng)為3′-內切酶。還有一些核酸內切酶對磷酸酯鍵一側的堿基有專(zhuān)一要求，例如胰臟核糖核酸酶（RNaseA）即是一種高度專(zhuān)一性核酸內切酶，它作用于嘧啶核苷酸的C′3上的磷酸根和相鄰核苷酸的C′5之間的鍵，產(chǎn)物為3′嘧啶單核苷酸或以3′嘧啶核苷酸結尾的低聚核苷酸
20世紀70年代，在細菌中陸續發(fā)現了一類(lèi)核酸內切酶，能專(zhuān)一性地識別并水解雙鏈DNA上的特異核苷酸順序，稱(chēng)為限制性核酸內切酶（restriction endonuclease，簡(jiǎn)稱(chēng)限制酶）。當外源DNA侵入細菌后，限制性?xún)惹忻缚蓪⑵渌馇谐善?，從而限制了外源DNA在細菌細胞內的表達，而細菌本身的DNA由于在該特異核苷酸順序處被甲基化酶修飾，不被水解，從而得到保護。
近年來(lái)，限制性核酸內切酶的研究和應用發(fā)展很快，目前已提純的限制性核酸內切酶有100多種，許多已成為基因工程研究中必不可少的工具酶。
限制性核酸內切酶可被分成三種類(lèi)型。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶水解DNA需要消耗ATP，全酶中的部分亞基有通過(guò)在特殊堿基上補加甲基基團對DNA進(jìn)行化學(xué)修飾的活性。
?、裥秃廷笮兔妇哂邢拗坪托揎梼煞N作用，而特異性弱，切割位點(diǎn)的序列不固定，不已知，不宜用于基因克隆中。
?、蛐拖拗泼杆釪NA不需要ATP也不以甲基化或其它方式修飾DNA，能在所識別的特殊核苷酸順序內或附近切割DNA。因此，被廣泛用于DNA分子克隆和序列測定。
LNA-Locked Nucleic Acid 一種類(lèi)寡核苷酸衍生物，結構中β-D-呋喃核糖的2'-O、
4’-C位通過(guò)縮水作用形成剛性的結構。LNA核苷酸包括A,C,G,T,U,mC六種堿基.
鎖核酸（Locked nucleic acid，LNA）是一種經(jīng)過(guò)修飾的RNA，LNA中一部分核糖上的2'與4'碳連結在一起。一般可見(jiàn)于A(yíng)-DNA或RNA。
這類(lèi)核酸可以增加引子或探針（probe）的融解溫度（Tm值），加強這些實(shí)驗用物質(zhì)的穩定性，可應用在即時(shí)聚合酶連鎖反應（real-time PCR）等技術(shù)中。
鎖核酸(locked nucleic acid,LNA)作為一種新穎的核苷酸衍生物在藥學(xué)研究領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注,有希望成為分子水平治療各種疾病的新突破口.它是一種特殊的雙環(huán)狀核苷酸衍生物,結構中含有一個(gè)或多個(gè)2 ′-O,4′-C-亞甲基-β-D-呋喃核糖核酸單體,核糖的2′-O位和4′-C位通過(guò)不同的縮水作用形成氧亞甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋,并連接成環(huán)形,這個(gè)環(huán)形橋鎖定了呋喃糖C3′-內型的N構型,降低了核糖結構的柔韌性,增加了磷酸鹽骨架局部結構的穩定性.由于LNA與DNA/RNA在結構上具有相同的磷酸鹽骨架,故其對DNA、RNA有很好的識別能力和強大的親和力.與其他寡核苷酸類(lèi)似物相比,LNA有很多優(yōu)點(diǎn):a.和DNA、RNA互補的雙鏈有很強的熱穩定性(ΔTm=3～8℃);b.抗3′脫氧核苷酸酶降解的穩定性;c.LNA-DNA雜交物能激活RNase H;d.水溶性好,自由穿入細胞膜,易被機體吸收;e.體內無(wú)毒性作用;f.高效的自動(dòng)寡聚化作用,合成方法相對簡(jiǎn)單,部分或完全修飾的LNA寡核酸鏈可用氨基磷酸法在DNA自動(dòng)合成儀上合成。
反義RNA是指與靶RNA(多為mRNA)具有互補序列的RNA分子,通過(guò)與靶RNA進(jìn)行堿基配對結合的方式.參與基因的表達調控.
詳細：反義核酸是指能與特定mRNA精確互補、特異阻斷其翻譯的RNA或DNA分子。利用反義核酸特異地封閉某些基因表達，使之低表達或不表達，這種技術(shù)即為反義核酸技術(shù)[1-3]。它包括反義RNA、反義DNA和核酶(ribozymes)三大技術(shù)。反義核酶作為一種基因下向調節作用因子，在抑制一些有害基因的表達和失控基因的過(guò)度表達上發(fā)揮著(zhù)重要作用。隨著(zhù)反義核酶技術(shù)的發(fā)展和成熟，已逐漸應用于抗某些人體寄生蟲(chóng)病的研究。本文擬就反義核酸技術(shù)的作用原理和特點(diǎn)作一簡(jiǎn)要概述，著(zhù)重闡述其在寄生蟲(chóng)領(lǐng)域中的應用進(jìn)展。
反義核酸的作用原理
反義核酸目前有三種來(lái)源：一是利用固相亞磷酰胺法人工合成的短小反義寡聚核苷酸(antisense oligodeoxyncleotides，AON)，這是反義核酸最普遍的應用方式，包括未修飾AON和硫代磷酸酯化(PS)、磷酸二酯化(PO)和甲基化等修飾AON二類(lèi)，其中以PSAON應用最廣泛。ANO設計合成簡(jiǎn)單，只要其順序與靶mRNA部分順序互補即可，而對基因的讀碼框無(wú)要求；二是更具有實(shí)用價(jià)值的工人表達載體，包括單個(gè)基因和多個(gè)基因的聯(lián)合反義表達載體[3]，它是利用基因重組技術(shù)將靶基因序列反向持插入到載體的啟動(dòng)子和終止子之間，通過(guò)轉錄可源源不斷產(chǎn)生反義RNA分子；三是天然存在的反義核酸分子，但目前分離純化尚存在困難。
反義RNA和反義DNA
反義RNA是指能和mRNA完全互補的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段，反義DNA是指能與基因DNA雙鏈中的有義鏈互補結合的短小DNA分子。反義RNA和反義DNA主要是通過(guò)mRNA的翻譯和基因DNA的轉錄而發(fā)揮作用[10]：1)抑制翻譯。反義核酸一方面通過(guò)與靶mRNA結合形成空間位阻效應，阻止核糖體與mRNA結合，另一方面其與mRNA結合后激活內源性RNase或ribozyme，降解mRNA[3]；2)抑制轉錄。反義DNA與基因DNA雙螺旋的調控區特異結合形成DNA三聚體(triplex),或與DNA編碼區結合，終止正在轉錄的mRNA鏈延長(cháng)[3]。此外，反義核酸還可抑制轉錄后mRNA的加工修飾，如5'端加帽、3'端加尾(poly a)、中間剪接和內部堿基甲基化等，并阻止成熟mRNA由細胞核向細胞漿內運輸。
核酶
Cech等發(fā)現四膜蟲(chóng)核糖體RNA前體在成熟過(guò)程中，可精確地自我切除某些片段并重新連接，這種具有酶催化活性的RNA稱(chēng)之為核酶。
核酶廣泛存在于生物細胞中，有錘頭狀和發(fā)夾二種結構。酶活性中心由兩個(gè)臂和中間的功能區組成[13]。兩個(gè)臂序列高度保守，與靶RNA特異互補結合，相當于一種反義RNA，而功能區則可通過(guò)降解RNA的磷酸二酯鍵而分解消化靶RNA，而核酶本身在作用過(guò)程中并不消耗。核酶裂解分子依賴(lài)嚴格的空間結構形成，裂解部位總是位于靶RNA分子中GUX三聯(lián)體(X：C、U、A)下游方向即3'端。
核酶除天然存在外，也可人工合成。根據核酶的作用位點(diǎn)、靶mRNA周?chē)男蛄泻秃嗣副旧砀叨缺Ｊ匦蛄?，可方便地人工設計合成核酶的特異性序列。此外，利用基因工程將核酶的編碼基因克隆在SP6或T7等啟動(dòng)子下游，通過(guò)轉錄合所需核酶。核酶能特異切割RNAA分子，使阻斷基因表達，特別是阻斷有害基因的表達成為可能。如果已知靶mRNA中GUX三聯(lián)體的位置，可將核酶的編碼基因插入反義表達載體的適當位置，這樣轉錄所產(chǎn)生的含有核酶的反義RNA具有雙重功能：一方面具有反義抑制作用，另一方面具有切割靶mRNA的催化作用。核酶在抗腫瘤、抗病毒方面具有十分誘人的前景，第一個(gè)應用核酶進(jìn)行艾滋病基因治療的臨床計劃已獲準，核酶作為一種遺傳信息藥物，在腫瘤基因治療中必將日益受到重視。
反義核酸的作用特點(diǎn)
反義核酸作為基因治療藥物之一，與傳統藥物相比具有諸多優(yōu)點(diǎn)。1)高度特異性：反義核酸藥物通過(guò)特異的堿基互補配對作用于靶RNA或DNA，猶如“生物導彈”。2)高生物活性、豐富的信息量；反義核酸是一種攜帶特定遺傳信息的信息體，堿基排列順序可千變萬(wàn)化，不可窮盡。3)高效性：直接阻止疾病基因的轉錄和翻譯。4)最優(yōu)化的藥物設計：反義核酸技術(shù)從本質(zhì)上是應用基因的天然順序信息，實(shí)際上是最合理的藥物設計。5)低毒、安全：反義核酸尚未發(fā)現其有顯著(zhù)毒性，盡管其在生物體內的存留時(shí)間有長(cháng)有短，但最終都將被降解消除，這避免了如轉基因療法中外源基因整合到宿主染色體上的危險性。
化學(xué)及生物學(xué)意義上的探針(probe)，是指與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子?？贵w-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生長(cháng)因子-受體的相互作用都可以看作是探針與靶分子的相互作用。
核酸探針技術(shù)原理是堿基配對?；パa的兩條核酸單鏈通過(guò)退火形成雙鏈，這一過(guò)程稱(chēng)為核酸雜交。核酸探針是指帶有標記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于待測核酸樣品中特定基因序列的檢測。每一種病原體都具有獨特的核酸片段，通過(guò)分離和標記這些片段就可制備出探針，用于疾病的診斷等研究。
(一) 核酸探針的種類(lèi)
1.按來(lái)源及性質(zhì)劃分 可將核酸探針?lè )譃榛蚪MDNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核苷酸探針等幾類(lèi)。
作為診斷試劑，較常使用的是基因組DNA探針和cDNA探針。其中，前者應用最為廣泛，它的制備可通過(guò)酶切或聚合酶鏈反應(PCR)從基因組中獲得特異的DNA后將其克隆到質(zhì)?；蚴删w載體中，隨著(zhù)質(zhì)粒的復制或噬菌體的增殖而獲得大量高純度的DNA探針。將 RNA進(jìn)行反轉錄，所獲得的產(chǎn)物即為cDNA。cDNA探針適用于RNA病毒的檢測。cDNA探針序列也可克隆到質(zhì)?；蚴删w中，以便大量制備。
將信息RNA(mRNA)標記也可作為核酸分子雜交的探針。但由于來(lái)源極不方便，且RNA極易被環(huán)境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此應用較少。
用人工合成的寡聚核苷酸片段做為核酸雜交探針應用十分廣泛，可根據需要隨心所欲合成相應的序列，可合成僅有幾十個(gè)bp的探針序列，對于檢測點(diǎn)突變和小段堿基的缺失或插入尤為適用
2.按標記物劃分 有放射性標記探針和非放射性標記探針兩大類(lèi)。放射性標記探針用放射性同位素做為標記物。放射性同位素是最早使用，也是目前應用最廣泛的探針標記物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P應用最普遍。放射性標記的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，可以檢測到Pg級；缺點(diǎn)是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不穩定、成本高等。因此，放射性標記的探針不能實(shí)現商品化。目前，許多實(shí)驗室都致力于發(fā)展非放射性標記的探針。
目前應用較多的非放射性標記物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一種小分子水溶性維生素，對親和素有獨特的親和力，兩者能形成穩定的復合物，通過(guò)連接在親和素或抗生物素蛋白上的顯色物質(zhì)(如酶、熒光素等)進(jìn)行檢測。地高辛是一種類(lèi)固醇半抗原分子，可利用其抗體進(jìn)行免疫檢測，原理類(lèi)似于生物素的檢測。地高辛標記核酸探針的檢測靈敏度可與放射性同位素標記的相當，而特異性?xún)?yōu)于生物素標記，其應用日趨廣泛。
(二) 核酸探針的標記
1.放射性同位素標記法 常將放射性同位素如32 P連接到某種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)上做為標記物，然后通過(guò)切口平移法標記探針。
切口平移法(nick translation)是利用大腸桿菌DNA聚合酶I (E.coli DNA polymerase I) 的多種酶促活性將標記的dNTP摻入到新形成的DNA鏈中去，形成均勻標記的高比活DNA探針。其操作方法如下：
(1) 取1?g DNA溶于少量無(wú)菌雙蒸水中，加入5?l距離大約10×切口平移緩沖液 ( 0.5mol/L Tris－HCl，PH7.2；0.1 mol/L MgSO4 ；1mmol/L二硫蘇糖醇；500?g/mL牛血清白蛋白)，加入除標記物(如?-32 p-dATP)外的其它三種dNTP(如dCTP，dGTP，dTTP)溶液，20mmol/L溶液各1?l。
(2) 加入100?ci(10?l)標記物溶液，加入無(wú)菌雙蒸水至終體積為46.5?l,混勻，加入0.5?l稀釋的DNaseI溶液，混勻；加入1?l(約5單位)E.coli DNA polymerase I，混勻。
(3) 置14-16℃反應1-2小時(shí)。
2.非放射性標記法 可將生物素、地高辛連接在dNTP上，然后象放射性標記一樣用酶促聚合法摻入到核酸鏈中制備標記探針。也可讓生物素、地高辛等直接與核酸進(jìn)行化學(xué)反應而連接上核酸鏈。其中，生物素的光化學(xué)標記法較為常用。其原理是利用能被可見(jiàn)光激活的生物素衍生物-光敏生物素(photobiotin)，光敏生物素與核酸探針混合后，在強的可見(jiàn)光照射下，可與核酸共價(jià)相連，形成生物素標記的核酸探針?？蛇m用于單、雙鏈DNA及RNA的標記，探針可在-20℃下保存8-10個(gè)月以上。具體操作方法如下：
(1) 將雙鏈DNA變性或用NaOH處理形成缺口，單鏈DNA或RNA毋需處理，將核酸樣品溶于水。
(2) 暗室下在微量離心管中加入10?g DNA，1mg/ml光敏生物素20?l，加水至50?l，混勻。
(3) 冰浴中打開(kāi)離心管蓋，在300-500瓦燈下照射10分鐘(液面距燈泡10cm)。
(4) 加入100?l 0.1mol/L Tris－HCl，pH8.0，加入100?l 2-丁醇抽提兩次，離心，棄上層。
(5) 乙醇沉淀核酸探針；用70％乙醇漂洗真空抽干，備用。
除上述標記法外，探針的制備和標記還可通過(guò)PCR反應直接完成。
(三) 核酸雜交 雜交技術(shù)有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術(shù)目前較為常用，先將待測核酸結合到一定的固相支持物上，再與液相中的標記探針進(jìn)行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，簡(jiǎn)稱(chēng)NC膜)或尼龍膜(nylon membrane)。
固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個(gè)基本過(guò)程：第一，通過(guò)印跡技術(shù)將核酸片段轉移到固相支持物上；第二，用標記探針與支持物上的核酸片段進(jìn)行雜交；第三，雜交信號的檢測。
用探針對細胞或組織切片中的核酸雜交并進(jìn)行檢測的方法稱(chēng)之為核酸原位雜交。某特點(diǎn)是靶分子固定在細胞中，細胞固定在載玻片上，以固定的細胞代替純化的核酸，然后將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進(jìn)入組織細胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細胞內。例如?？捎锰禺愋缘募毦?、病毒的核酸做為探針對組織、細胞進(jìn)行原位雜交，以確定有無(wú)該病原體的感染等。原位雜交不需從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，在臨床應用上有獨特的意義。
近年來(lái)液相雜交技術(shù)有所發(fā)展。液相雜交與固相雜交的主要區別是不用純化或固定的靶分子，探針與靶序列直接在溶液里作用。液相雜交步驟有所簡(jiǎn)化，雜交速度有所提高，增加了特異性和敏感性，但與臨床診斷所要求的特異性和敏感性還有一定的距離。
各種雜交技術(shù)中，膜上印跡雜交技術(shù)應用最為廣泛，它由以下三個(gè)基本過(guò)程組成。
1.核酸印跡技術(shù)
(1) 斑點(diǎn)印跡(Dot-blot) 將待測核酸樣品變性后直接點(diǎn)樣在膜上，稱(chēng)之為斑點(diǎn)印跡。為使核酸牢固結合在膜上，通常還將點(diǎn)樣后的膜進(jìn)行80℃真空烘烤2h。
應用斑點(diǎn)印跡技術(shù)，可在一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測，操作簡(jiǎn)便、快速，在臨床診斷中應用較廣。適合進(jìn)行特定基因的定性及定量研究，但不能鑒定所測基因的分子量。
(2) Southern印跡(Southern blot) 這是指將DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后轉移到固相支持物上的過(guò)程。
常規處理如下，先用限制性?xún)惹忻笇NA樣品進(jìn)行酶切處理，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA片段按分子量大小分離，接著(zhù)對凝膠進(jìn)行變性處理，使雙鏈DNA解離成單鏈，并將其轉移到NC膜或其它固相支持物上，轉移后各DNA片段的相對位置保持不變。用探針與經(jīng)Southern印跡處理的DNA樣品雜交，可鑒定待測DNA的大小、進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片段長(cháng)度多態(tài)性分析(RFLP)等。
Southern印跡的操作方法有三種：
?、?毛細管轉移(或虹吸印跡)。這是一傳統方法，進(jìn)行毛細管轉移時(shí)，DNA片段由液流攜帶從凝膠轉移到固相支持物表面。安放裝置時(shí)，在轉移槽中央的平臺上由下到上依次疊放變性凝膠、濾膜、一疊干的吸水紙巾；凝膠與轉移緩沖液通過(guò)一紙橋連接；濾膜上的紙巾吸水而產(chǎn)生并維持毛細管作用，液體由于毛細管作用抽吸通過(guò)凝膠，并將DNA片段攜帶聚集在濾膜上。DNA片段的大小和瓊脂的濃度決定了轉移的速度。小片段DNA(＜1kb)在1小時(shí)內可從 0.7％瓊脂糖凝膠上幾乎定量轉移，而大片段DNA的轉移較慢且效率較低，如大于15kb的 DNA片段需要18小時(shí)而轉移尚不完全。
?、?電轉移。利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉移到固相支持物上，可達到簡(jiǎn)單、迅速、高效的目的。一般2-3小時(shí)內可轉移完畢。電轉法不宜采用NC膜，因為NC膜結合 DNA依賴(lài)高鹽溶液，而高鹽溶液在電泳過(guò)程中會(huì )破壞緩沖體系，使DNA損傷。一般使用化學(xué)活化膜和正電荷修飾的尼龍膜。此外，電轉過(guò)程中轉移體系的溫度升高，必須使用循環(huán)冷卻水。商業(yè)化的電轉儀一般附有冷卻設備，也可在冷室中進(jìn)行。具體操作時(shí)，按儀器使用說(shuō)明安裝電轉裝置，將變性凝膠夾在轉移膜內平行電極內側的多孔板之間，排除夾層間氣泡，加入轉移緩沖液并通電進(jìn)行電轉。
?、?真空印跡法 這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA和RNA印跡法。其基本原理是利用真空作用將轉膜緩沖液從凝膠上層的容器抽到下層，凝膠中的核酸片段將隨緩沖液移置到凝膠下面的固相支持物上。這一方法的最大優(yōu)點(diǎn)是快速高效，可在轉膜的同時(shí)進(jìn)行DNA的變性與中和，30分鐘至1小時(shí)可完成，適合檢疫工作的要求。已有商業(yè)化的真空轉移儀提供，可按商品使用說(shuō)明進(jìn)行操作。
Southern印跡后的濾膜仍需進(jìn)行固定處理，對NC膜可用80℃真空烘烤2小時(shí)，對尼龍膜還可用短波紫外線(xiàn)(波長(cháng)254nm)照射幾分鐘。
(3) Northern印跡(Northern blot) Northern印跡是指將RNA片段變性及電泳分離后，轉移到固相支持物上的過(guò)程。RNA樣品經(jīng)Northern印跡后進(jìn)行雜交反應可鑒定其中特異 mRNA分子的量與大小。
Northern印跡的方法與Southern印跡基本相同，可參照進(jìn)行。但RNA的變性方法與 DNA不同。DNA樣品可先通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行分離，再用堿處理凝膠使DNA變性。而RNA不能用堿變性,因為堿會(huì )導致RNA水解。因此，在Northern印跡前，須進(jìn)行RNA變性電泳，在電泳過(guò)程中使RNA解離形成單鏈分布在凝膠上，再進(jìn)行印跡轉移。
RNA變性電泳的原理，是用一定劑量的乙二醛-二甲基亞礬，或甲醛和甲基氫氧化汞等處理RNA樣品和凝膠，使雙鏈RNA在電泳過(guò)程中變性而完全解離形成單鏈。
2.雜交反應的基本過(guò)程 雜交反應包括預雜交、雜交和漂洗幾步操作。
預雜交的目的是用非特異性DNA分子(鮭精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物(Denhart’s溶液)將待測核酸分子中的非特異性位點(diǎn)封閉，以避免這些位點(diǎn)與探針的非特異性結合。雜交反應是使單鏈核酸探針與固定在膜上的待測核酸單鏈在一定溫度和條件下進(jìn)行復性反應的過(guò)程。雜交反應結束后，應進(jìn)行洗膜處理以洗去非特異性雜交以及未雜交的標記探針，以避免干擾特異性雜交信號的檢測。膜洗凈后,將繼續進(jìn)行雜交信號的檢測。
(1) 以放射性標記探針與固定在NC膜上的核酸進(jìn)行雜交為例，雜交反應操作如下：
?、?配制所需試劑
SSC溶液(20×)：3mol/L NaCl，0.3mol/L檸檬酸鈉。
Denhardt’s溶液(50×)：聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白(BSA)5g加水至500ml。
預雜交液：6×SSC，5×Denhardt’s溶液，0.5％SDS，100?g/ml經(jīng)變性或斷裂成片段的鮭精DNA。
?、?將含靶核酸的NC膜漂浮于6×SSC液面，使其由下至上完全濕潤，并繼續浸泡2分鐘。
?、?將濕潤NC膜裝入塑料袋中，按0.2ml/cm2的量加入預雜交液，盡可能擠出氣泡，將袋封口，置68℃水浴1-2小時(shí)或過(guò)夜。
?、?將雙鏈探針做變性處理使成單鏈，即于100℃加熱5分鐘，然后立即置冰浴使驟冷。
?、?從水浴中取出雜交袋，剪去一角，將單鏈探針加入，盡可能將袋內空氣擠出去，重新封口，并將雜交袋裝入另一個(gè)干凈的袋內，封閉，以防放射性污染。
?、?將雜交袋浸入68℃水浴，溫育8-16小時(shí)。
?、?取出雜交袋，剪開(kāi)，取出濾膜迅速浸泡于大量2×SSC和0.5％SDS中，室溫振蕩5分鐘，勿使濾膜干燥。
?、?將NC膜移入盛有大量2×SSC和0.1％SDS溶液的容器中，室溫漂洗15分鐘。
?、?將NC膜移入一盛有大量0.1×SSC和0.5％SDS溶液的容器中，37℃漂洗30分鐘至1小時(shí)。
?、?將NC膜移入一盛有新配0.1×SSC和0.5％SDS溶液的容器中，68℃漂洗30分鐘至1小時(shí)。
?、?取出濾膜，用0.1×SSC室溫稍稍漂洗，然后置濾紙上吸去大部分液體，待做雜交信號的檢測。
3雜交信號的檢測 當探針是放射性標記時(shí)，雜交信號的檢測通過(guò)放射自顯影進(jìn)行。即利用放射線(xiàn)在X光片上的成影作用來(lái)檢測雜交信號。操作時(shí)，在暗室內將濾膜與增感屏、X光片依序放置暗盒中，再將暗盒置-70℃曝光適當時(shí)間，取出X光片，進(jìn)行顯影和定影處理。
對于非放射性標記的探針，則需將非放射性標記物與檢測系統偶聯(lián)，再經(jīng)檢測系統的顯色反應來(lái)檢測雜交信號。以地高辛的堿性磷酸酶檢測反應為例，地高辛(Dig)是一種半抗原，雜交反應結束后，可加入堿性磷酸酶標記的抗Dig抗體，使之在膜上的雜交位點(diǎn)形成酶標抗體Dig復合物，再加入酶底物如氮藍四唑鹽(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸甲苯胺鹽(BCIP)，在酶促作用下，底物開(kāi)始顯藍紫色。其基本反應程序類(lèi)似ELISA，雜交信號的強弱，通過(guò)底物顯色程度的深淺、有無(wú)來(lái)確定。
核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統方法。其原理是核酸變性和復性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開(kāi)，而在條件恢復后又可依堿基配對規律形成雙邊結構。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行，因此又稱(chēng)為核酸印跡雜交。根據檢測樣品的不同又被分為DNA印跡交（Southern blot hybridization ）和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization）。其基本過(guò)程包括下列幾個(gè)步驟。
?。?）制備樣品：首先需要從待檢測組織樣品提取DNA或RNA。DNA應先用限制性?xún)惹忻赶援a(chǎn)生特定長(cháng)度的片段，然后通過(guò)凝膠電泳將消化產(chǎn)物按分子大小進(jìn)行分離。一般來(lái)說(shuō)DNA分子有其獨特的限制性?xún)惹忻笀D譜，所以經(jīng)酶切消化和電泳分離后可在凝膠上形成特定的區帶。再將含有DNA片段的凝膠進(jìn)行變性處理后，直接轉印到支持膜上并使其牢固結合。這樣等檢測片段在凝膠上的位置就直接反映在了轉印在膜上。RNA樣品則可直接在變性條件下電泳分離，然后轉印并交聯(lián)固定。
?。?）制備探針：探針是指一段能和待檢測核酸分子依堿基配對原則而結合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸雜交實(shí)驗中，探針需要被標記上可直接檢測的元素或分子。這樣，通過(guò)檢疫與恩印膜上的核酸分子結合上的探針?lè )肿?，既可知道被檢測的核酸片段在膜上的位置，也就是在電泳凝膠上的位置，也就知道了它的分子大小。
?。?）雜交：首先要進(jìn)行預雜交，即用非特異的核酸溶液封閉膜上的非特異性結合位點(diǎn)。由于轉印在膜上的核酸分子已經(jīng)是變性的分子，所以雜交過(guò)程中只需變性標記好的探針，再讓探針與膜在特定的溫度下反應，然后洗去未結合的探針?lè )肿蛹纯伞?br> ?。?）檢測：檢測的方法依標記探針的方法而異。用放射性同位素標記的探針需要用放射自顯影來(lái)檢測其在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法標記的探針則需要用相應的免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行檢測。
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