新型分子標記——SRAP與TRAP及其應用
轉貼自：科技長(cháng)廊
傳統作物育種過(guò)程主要依賴(lài)于植株的表型選擇（phenotypic selection），性狀選擇效果難以提高。遺傳標記特別是基于DNA多態(tài)性的分子標記在作物遺傳連鎖圖譜構建、重要性狀基因標記定位與克隆、種質(zhì)資源遺傳多樣性與系統發(fā)育分析、品種指紋圖譜繪制及遺傳純度檢測等方面廣泛應用，尤其是分子標記輔助選擇(molecular marker-assisted selection, MAS)為育種工作提供了極大方便，可顯著(zhù)提高育種的選擇效率與育種預見(jiàn)性。
1 現有的分子標記
目前分子標記技術(shù)主要有RFLP、RAPD、ISSR、 AFLP、 SSR、SCAR和單核苷酸多態(tài)性 (SNP)、表達序列標簽 (EST)等。由于PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，基于PCR的標記體系類(lèi)型多樣，應用廣泛，但各自的復雜性、可靠性與遺傳信息不同。如RAPD方法簡(jiǎn)單、成本低，但重復性較差、檢測位點(diǎn)不多；SSR多為共顯性、重復性好，但位點(diǎn)較少、引物開(kāi)發(fā)成本高；AFLP譜帶多，但分析程序復雜、成本高，有時(shí)要用到同位素，而且甲基化敏感的限制酶由于基因組DNA的甲基化可導致“假多態(tài)性”產(chǎn)生，識別AATT位點(diǎn)的MseI酶常會(huì )引起一些物種基因組中標記分布不均衡；多數情況下，RAPD與AFLP標記測序需要克隆，增加了工作量。
2 SRAP標記體系分析原理與方法
相關(guān)序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是一種新型的基于PCR的標記系統，由美國加州大學(xué)蔬菜作物系Li與Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列擴增多態(tài)性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP）。
2.1 SRAP標記引物設計原理
引物設計是SRAP分析的核心。SRAP標記分析共有兩套引物。在一組正向SRAP引物中使用“CCGG”序列，其目的是使之特異結合可譯框（ORFs）區域中的外顯子。研究表明外顯子一般處于富含GC區域，如擬南芥2和4號染色體的全序列中，外顯子CG比例分別為46.5%和44.08%，而內含子中則為 32.1%和33.08 %；而且除著(zhù)絲粒區域有較低基因密度外，基因幾乎平均分布在這兩個(gè)染色體上。從GenBank中隨機選擇20個(gè)BAC序列，發(fā)現約66%的CCGG序列位于這些克隆中的外顯子內。據統計，擬南芥約1/3基因組外顯子位于2、4號染色體上。運用CCGG序列就可特異擴增出包含這些組分的序列。
當然，由于外顯子序列在不同個(gè)體中通常是保守的，這種低水平多態(tài)性限制了將它們做為標記的來(lái)源。由于內含子、啟動(dòng)子和間隔序列在不同物種甚至不同個(gè)體間變異很大，富含AT的區域序列通常見(jiàn)于啟動(dòng)子和內含子中，SRAP中使用的反向引物的3′ 端含有核心AATT，以特異結合富含AT區，這就使得有可能擴增出基于內含子與外顯子的SRAP多態(tài)性標記。
2.2 引物設計與應用
引物大小和引物組合是成功進(jìn)行SRAP分析的關(guān)鍵。SRAP-PCR反應體系中使用兩個(gè)引物：17堿基正向引物（F-primer）和18堿基反向引物(R-primer)；早期反向引物在3’端選擇性核苷前多一個(gè)C（19個(gè)）；使用同位素檢測時(shí)引物可用33P-ATP標記。正向引物含有一段14堿基的核心序列（core sequence）：5′端前10個(gè)堿基為“填充”序列（filler sequence），無(wú)任何特異組成，接著(zhù)為CCGG序列；隨后為3′ 端的3個(gè)選擇性堿基，選擇性堿基的變化與相同核心序列組合成一套正向引物。反向引物的組成與正向引物類(lèi)似，但“填充”序列后連接的為AATT；AATT序列后為3個(gè)選擇性可變堿基，位于引物3′ 端。當然，構建正向與反向引物的總體要求是它們不形成發(fā)夾結構及其他二級結構，且CG含量為40%－50%，且兩者“填充”序列在組成上必須不同，長(cháng)度為10或11個(gè)堿基。
目前文獻中報道的部分標準引物序列如下：
正向引物Forward primer 反向引物Reverse primer
me1:5′TGAGTCCAAACCGGATA-3′ em1:5′GACTGCGTACGAATTAAT-3′
me2:5′TGAGTCCAAACCGGAGC-3′ em2: 5′GACTGCGTACGAATTTGC-3′ <>< p="">
me3:5′TGAGTCCAAACCGGAAT-3′ em3: 5′GACTGCGTACGAATTGAC-3′
me4:5′TGAGTCCAAACCGGACC-3′ em4: 5′GACTGCGTACGAATTTGA-3′
me5:5′TGAGTCCAAACCGGAAG-3′ em5: 5′GACTGCGTACGAATTAAC-3′
me6:5′TGAGTCCAAACCGGTAA-3′ em6: 5′GACTGCGTACGAATTGCA-3′
me7:5′TGAGTCCAAACCGGTCC-3′ em7: 5′GACTGCGTACGAATTCAA-3′
me8:5′TGAGTCCAAACCGGTGC-3′ em8: 5′GACTGCGTACGAATTCTG-3′
em9: 5′GACTGCGTACGAATTCGA-3′
em10: 5′GACTGCGTACGAATTCAG-3′
em11: 5′GACTGCGTACGAATTCCA-3′
實(shí)驗表明，用單引物擴增只能擴增幾條大約0.5~1kb的片段；使用較短引物，10堿基RAPD引物，以及含有SRAP引物核心序列的14－15堿基大小的引物，這些引物組合可得到多種擴增片段，但是擴增產(chǎn)物不穩定，特異性不強；20-22堿基引物放射自顯影的結果背景太強；合適的引物大小在17－18堿基。
2.3 SRAP-PCR擴增
反應模板多數是基因組DNA，也可以是cDNA。在一個(gè)標準PCR反應體系中，0.2mmol/L dNTPs,1.5mmol/L Mgcl2,0.3µmol/L引物，1U Taq酶。SRAP-PCR反應采用復性變溫法：開(kāi)始94℃變性5min；反應前5個(gè)循環(huán)在94℃ 1min，35℃ 1 min，72℃ 1－2 min條件下運行；之后30－35個(gè)循環(huán)復性溫度提高到50℃，最后延伸5~7 min。
前5個(gè)循環(huán)復性溫度設為35℃ ，主要是考慮到低的復性溫度能確保兩個(gè)引物與靶DNA部分配對；隨后循環(huán)中復性溫度升到50℃，可保證前5個(gè)循環(huán)的擴增產(chǎn)物可在余下循環(huán)中進(jìn)行指數式擴增；如果復性溫度在40個(gè)循環(huán)中都保持在35℃，擴增片段重復性將很低。
2.4擴增產(chǎn)物檢測與片段測序
擴增產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上分離，通常膠板35 cm×43cm，厚度0.8mm，每孔加樣 8－20 微升，以保證單條帶足夠量回收?？墒褂猛凰?，也可采用銀染技術(shù)；用2.0%的瓊脂糖凝膠也可分析多態(tài)性，但分辨的條帶較少。
對標記測序有可能獲得更多的遺傳信息。由于多數SRAP產(chǎn)生高強帶，很少有重疊，而且引物較長(cháng)，故比AFLP易測序。獲得的SRAP標記差異片段，從膠上割下、回收后，用相應引物直接測序，必要時(shí)可采用克隆測序。
2.5 SRAP標記特征
由于在設計引物時(shí)正反引物分別是針對序列相對保守的編碼區與變異大的內含子、啟動(dòng)子和間隔序列，因此，多數SRAP標記在基因組中分布是均勻的，通過(guò)利用RIL系構建的遺傳連鎖圖也說(shuō)明了這一點(diǎn)。同時(shí)發(fā)現在130個(gè)SRAP標記中，約20%為共顯性，這種高頻率的共顯性則明顯優(yōu)于A(yíng)FLP標記。
利用同一引物組合，從甘藍類(lèi)不同作物中（包括花椰菜、青花菜等）可獲得多個(gè)SRAP標記。單個(gè)組合在每個(gè)個(gè)體中可檢測到至少10條多態(tài)性譜帶，其中一些為作物特異的；在不同的實(shí)驗中多態(tài)性條帶重復性極好。 SRAP標記測序顯示多數標記為外顯子區域。25條多態(tài)性帶中16條（64%）序列GC含量超過(guò)35%，表明可能是外顯子部分；Blast搜索表明60%條帶與已知基因序列高度一致，這就確認了SRAP產(chǎn)生的多數標記包含了可譯框中的外顯子。測序還表明SRAP多態(tài)性產(chǎn)生于兩個(gè)方面：由于小的插入與缺失導致片段大小改變，而產(chǎn)生共顯性標記；核苷酸改變影響引物的結合位點(diǎn)，導致顯性標記產(chǎn)生。<>< p="">
3. TRAP標記原理與方法
靶位區域擴增多態(tài)性 (target region amplified polymorphism，TRAP)也是一種新型的基于PCR標記，由美國農部北方作物科學(xué)實(shí)驗室Hu與Vick于2003年提出。與SRAP、RAPD和AFLP等標記技術(shù)無(wú)須任何序列信息即可直接PCR擴增不同，TRAP技術(shù)是基于已知的cDNA 或EST序列信息。目前已獲得許多物種基因組序列的豐富信息，包括人類(lèi)、擬南芥，以及重要作物水稻和多種微生物的基因組序列草圖繪制成功，有大量的EST序列可供使用，從而使得可以利用生物信息學(xué)工具和EST數據庫信息產(chǎn)生出許多靶基因序列的TRAP多態(tài)性標記，而且極易將性狀與標記相關(guān)聯(lián)。
TRAP技術(shù)是從SRAP技術(shù)改進(jìn)而來(lái)的。SRAP使用兩個(gè)任意引物；而TRAP是使用長(cháng)度為16~20核苷的固定引物（fixed primer）與任意引物(arbitrary prime)，固定引物以公用數據庫中的靶EST序列設計而來(lái)；任意引物與SRAP所用的一樣，為一段以富含AT或GC為核心、可與內含子或外顯子區配對的隨機序列。固定引物的設計步驟為：從EST數據庫中鑒別所需序列，再采用有關(guān)引物設計軟件（如Primer3等） 設定核苷酸序列合理長(cháng)度（18堿基）與最適、最大和最小Tm值（53、55、50℃），最后選定最適的引物; 任意引物設計完全同SRAP技術(shù)。TRAP-PCR反應條件與SRAP-PCR完全一致。每次TRAP-PCR反應在6.5%聚丙烯酰胺測序膠可產(chǎn)生50－900bp的片段30-50 個(gè)。
4 應 用
SRAP分子標記系統最早是在蕓薹屬作物開(kāi)發(fā)出來(lái)。目前已在其他作物如馬鈴薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、蘋(píng)果、櫻桃、柑橘與芹菜中也成功擴增。TRAP技術(shù)是在向日葵中開(kāi)發(fā)的，目前已成功應用于其他作物如水稻、菜豆、大麥、小麥、甜菜。主要用于種質(zhì)資源的鑒定評價(jià)、遺傳圖譜的構建、重要性狀基因標記、gDNA與cDNA指紋分析乃至圖位克隆等方面。
4.1種質(zhì)資源的鑒定評價(jià)
由于在不同物種、不同個(gè)體間具有一定的多態(tài)性，SRAP技術(shù)也成功應用于種質(zhì)鑒定與評價(jià)工作中。Ferriol等（2003）對甜瓜（Cucurbita pepo）的2個(gè)變種69份類(lèi)型代表性材料遺傳多樣性進(jìn)行了SRAP、AFLP標記與形態(tài)學(xué)分析，結果表明，與形態(tài)學(xué)變異及類(lèi)型的進(jìn)化歷史一致性方面，SRAP標記提供的信息比AFLP標記更優(yōu)良；11個(gè)SRAP引物組合獲得88條可重復的條帶，平均8條，其中64條（72.7%）為多態(tài)，大小在154-653bp 之間；測序發(fā)現多個(gè)標記序列與已知cDNA或EST高度同源。另外還利用SRAP標記對筍瓜（C.maxima）19 份種質(zhì)及8份南瓜屬材料遺傳多樣性進(jìn)行分析，24個(gè)引物組合產(chǎn)生的114個(gè)標記中多態(tài)性占33%，雖然低于RAPD比例，但聚類(lèi)分析與主坐標分析表明，SRAP標記分析可將材料按照使用類(lèi)型（食用、飼用、觀(guān)賞用）來(lái)分組。因此，在對育種目標性狀的評價(jià)方面，明顯優(yōu)于RAPD標記。
野牛草（Buffalograss）生長(cháng)緩慢、耐旱、耐瘠、抗蟲(chóng)，倍性多樣，遺傳基礎廣泛。Budak等利用SRAP標記分析了buffalograss的43個(gè)基因型遺傳多樣性，結果也表明SRAP是一個(gè)評價(jià)遺傳多樣性、品種鑒定和系統發(fā)生的有效工具。
向日葵屬野生種在栽培品種遺傳改良方面很有價(jià)值，對于重要病害，尤其是霜霉病是很好的抗源，但大部分野生種是多年生，從野生種中鑒定基因非常困難。Hu等設計了與向日葵EST數據庫中編碼富含亮氨酸重復（LRR）類(lèi)似蛋白序列配對的固定引物，利用TRAP標記分析，對向日葵屬16個(gè)野生種及其2個(gè)雜交種的遺傳變異性進(jìn)行評估。結果表明TRAP標記可用于評估向日葵的遺傳多樣性，材料的聚類(lèi)結果與經(jīng)典分類(lèi)相一致；其中一個(gè)TRAP引物結合到與抗病性有關(guān)的基因序列。表明TRAP技術(shù)將在種質(zhì)基因型鑒別和重要目的農藝性狀的基因標記方面存在廣泛的應用前景。
4.2 遺傳圖譜構建
利用collard × cauliflower形成的RIL86個(gè)群體，構建了由130個(gè)SRAP、120個(gè)AFLP標記組成的遺傳圖譜。類(lèi)似AFLP標記，SRAP均勻分布平衡在9個(gè)重要連鎖群上。高頻率共顯性與在基因組中均勻分布的特性將使其優(yōu)于A(yíng)FLP標記而成為一個(gè)構建遺傳圖譜的良好標記體系。
4.3 繪制基因組轉錄圖譜（transcriptome map）
轉錄圖譜（transcriptome map）是進(jìn)行比較基因組學(xué)研究極為有效手段。利用基于PCR的cDNA-SRAP分析來(lái)檢測編碼區的多態(tài)性將簡(jiǎn)便、高效、快捷。利用花椰菜DH植株與青花菜雜交產(chǎn)生的F2群體88個(gè)單株，使用48引物組合，從88個(gè)cDNA中檢測到281個(gè)多態(tài)性cDNA -SRAP標記，平均每個(gè)引物對產(chǎn)生6個(gè)，21.1%為共顯性；構建了由247個(gè)標記組成的轉錄圖譜。利用這個(gè)圖譜，成功進(jìn)行了甘藍類(lèi)蔬菜作物與擬南芥基因組的基因排列與組成分析，發(fā)現這兩類(lèi)基因組的廣泛同一性，在190個(gè)多態(tài)性cDNA-SRAP標記中，共有169個(gè)相似序列；這種同一性集中在某些染色體片段而非整個(gè)染色體上；甘藍中大多數重復區段集中對應于擬南芥1號與5號染色體，而不是2號與4號染色體。
4.4 重要性狀基因標記
重要農藝性狀基因緊密連鎖標記的獲得，將可進(jìn)行性狀分子標記輔助選擇，提高育種的選擇效率與預見(jiàn)性，加快新品種的選育進(jìn)程。常用的標記作圖群體有F2、BC1、DH、RIL等，標記策略有BSA、NIL以及GRA等。BoGLS-ALK基因是十字花科中調節脂肪族芥子油糖苷脫飽和基因。利用RIL群體，采用SRAP技術(shù)，將該基因定位到連鎖群L1，距顯性標記SRAP133 1.4cM。
Li等于2003年在大白菜中也發(fā)現了一個(gè)與雄性不育基因有關(guān)的SRAP標記，在油菜中篩選到一個(gè)與Rf連鎖的SRAP標記，在芹菜中獲得一個(gè)與病毒抗性基因緊密連鎖的SRAP標記。
4.5 SRAP標記測序與基因克隆
多數SRAP標記包含了可譯框中的外顯子，這為特定性狀基因的分離克隆提供了極大方便。進(jìn)一步測序與Blast分析發(fā)現，通過(guò)RIL群體獲得BoGLS-ALK基因的顯性標記SRAP133 與擬南芥中BAC克隆F4C21中一未知基因的可譯框高度同源，該基因位于5號染色體上，此基因座已經(jīng)定位了一個(gè)去飽和基因。據此推測標記SRAP133也在這個(gè)基因內部。
綜合運用擬南芥相關(guān)基因序列信息，應用SRAP技術(shù)對青花菜BAC克隆測序，最終克隆了芥子油糖苷合成途徑中一關(guān)鍵基因BoGLS-ELONG。
Li等利用SRAP技術(shù)獲得一個(gè)與BoGLS-ALK基因共分離的標記，再用此標記序列來(lái)篩選青花菜BAC文庫的一個(gè)BAC克隆，成功分離到BoGLS-ALK基因；并通過(guò)遺傳轉化導入擬南芥，進(jìn)行了該基因的功能分析。同時(shí)正在從結球白菜的花粉母細胞、減數分裂期的花蕾分離出mRNA，進(jìn)行cDNA的SRAP指紋圖譜分析，以期克隆一些特異表達的基因，并初步獲得PMC特異表達的基因。<>< p=""><>< p="">
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