2016年年底，來(lái)自加州大學(xué)伯克利分校的幾位科學(xué)家在Nature Reviews Drug Discovery（影響因子47.12）雜志上發(fā)表了一篇題為“Cornerstones of CRISPR–Cas in drug discovery and therapy”的綜述文章。CRISPR“女神”Jennifer A. Doudna教授是這篇文章的共同作者。
基因組編輯工具CRISPR–Cas系統的飛速發(fā)展引發(fā)了生物學(xué)領(lǐng)域的一場(chǎng)革命?；贑RISPR–Cas的技術(shù)實(shí)現了幾乎無(wú)限制的基因操作，包括在人類(lèi)細胞中。在這一綜述中，作者們討論了CRISPR–Cas如何通過(guò)加速高價(jià)值靶點(diǎn)識別和驗證、發(fā)現高可信度的生物標志物以及開(kāi)發(fā)不同的突破性療法影響下一代藥物的開(kāi)發(fā)。文章關(guān)注了這一革命性基因編輯技術(shù)將帶來(lái)的希望，以及存在的缺陷和障礙，討論了不同CRISPR–Cas篩選平臺的關(guān)鍵特性，提出了基因組編輯應用的最佳實(shí)踐方案。
文章在摘要中指出，通過(guò)在哺乳動(dòng)物模型系統和人體組織中實(shí)現快速、準確地改變基因組信息，基于CRISPR–Cas系統的基因編輯技術(shù)已準備好要改變藥物研發(fā)的多個(gè)階段。此外，在患者中直接的體細胞編輯將最終從根本上改變成藥空間（druggable space）。大量的研究證實(shí)了CRISPR–Cas系統多種巧妙的應用（圖1）。
這一綜述主要包括以下四個(gè)部分：1）CRISPR–Cas作為一種藥物發(fā)現工具（CRISPR–Cas as a tool for drug discovery）；2）CRISPR系統的特異性（Specificity of CRISPR systems）；3）利用CRISPR–Cas開(kāi)發(fā)治療方法（Using CRISPR–Cas to make therapeutics）；4）定義通往臨床之路（Defining a path to the clinic）。
第一部分：作為一種藥物發(fā)現工具
精準細胞模型
DNA測序的發(fā)展及其大規模的應用讓人們認識到了患者群體和普通人群之間的遺傳變異，同時(shí)擴大了我們對遺傳變異與疾病傾向、疾病發(fā)展以及治療響應之間關(guān)聯(lián)的理解。這些進(jìn)展刺激了個(gè)性化醫學(xué)或精準醫學(xué)的發(fā)展。然而，實(shí)現這兩種醫學(xué)模式往往需要精準的遺傳模型，用以評估擁有未知重要性的突變，優(yōu)化患者的分類(lèi)，開(kāi)發(fā)已批準藥物的新適應癥以及替代性的治療模式。經(jīng)典的同源重組技術(shù)可用于生成相關(guān)的細胞模型，但需要消耗大量的勞動(dòng)力和時(shí)間，阻礙了其在藥物開(kāi)發(fā)中的廣泛使用。CRISPR–Cas基因組編輯技術(shù)的出現大大改了這一現狀（圖2）。短短4年的時(shí)間，它已被全球的科研人員接受并使用。
功能篩選
隨著(zhù)研究人員揭開(kāi)不同篩選系統的優(yōu)缺點(diǎn)，CRISPR–Cas大規模的功能篩選功能同時(shí)也在發(fā)展和進(jìn)化。由于設計有效sgRNAs的簡(jiǎn)便性，以及能夠用于幾乎任何細胞類(lèi)型或組織，CRISPR–Cas篩選系統很快在各種情況下被采用。表1中，作者們比較了幾種篩選平臺的作用、機制、靶點(diǎn)選擇性等特點(diǎn)。
快速產(chǎn)生動(dòng)物模型
除了在細胞培養中的應用，基因組編輯也顯著(zhù)改變了我們產(chǎn)生疾病動(dòng)物模型的能力（圖3）。事實(shí)上，在CRISPR–Cas工具發(fā)展不久后，它們就已被用于動(dòng)物模型構建中。它的出現之所以會(huì )帶來(lái)新的希望，是因為傳統的基因靶向（gene targeting）在除小鼠之外的臨床前模型中依然是困難的。這幾年，CRISPR–Cas技術(shù)已被用于編輯大鼠、狗、獼猴。這些動(dòng)物模型也常用于臨床前的藥物開(kāi)發(fā)。
第二部分：CRISPR系統的特異性
盡管基于CRISPR的工具很容易靶向基本上任何的基因組位點(diǎn)，但它們也會(huì )產(chǎn)生脫靶編輯。脫靶位點(diǎn)是由核酸酶和sgRNA序列決定的。因此，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)出了大量預測sgRNA有效性和脫靶位點(diǎn)的算法。在這部分內容中，作者們談到了如何系統性地最小化CRISPR–Cas的脫靶效應。他們提到的3個(gè)方向是：1）需要兩個(gè)Cas9切口酶，部分相關(guān)成果于2013年以“Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity”為題發(fā)表在Cell雜志上；2）依賴(lài)sgRNA或蛋白質(zhì)工程實(shí)現更高的特異性；3）嚴格控制細胞中活躍的Cas9酶的數量。
第三部分：利用CRISPR–Cas開(kāi)發(fā)治療方法
除了用于產(chǎn)生強大的研究工具或模型，CRISPR–Cas技術(shù)本身也具有發(fā)展成藥物或療法的巨大潛能。在該部分內容中，作者們討論了治療用基因編輯的現狀，以及CRISPR–Cas將如何對這一領(lǐng)域做出貢獻。
利用基因編輯開(kāi)發(fā)CAR-T細胞療法
近幾年，癌癥免疫療法領(lǐng)域快速發(fā)展，科學(xué)家們也迅速將基因編輯技術(shù)應用到其中。目前，有大量的研究集中在將這一技術(shù)應用到CAR-T療法的開(kāi)發(fā)中。
目前，大部分的CAR-T細胞是利用患者自身的T細胞來(lái)產(chǎn)生。這是一個(gè)昂貴、耗時(shí)的過(guò)程。這一過(guò)程還受限于當前的生產(chǎn)制造能力。如果科學(xué)家們能夠想辦法生成通用型的CAR-T細胞，這類(lèi)療法將有望變得更便捷、更便宜。因為，這些現成的（off-the-shelf）細胞將增加能夠接受單一CAR-T細胞產(chǎn)品治療的患者數量。
移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）和宿主排斥依然是這種“off-the-shelf”途徑的主要障礙。包括ZFNs 和 TALENs在內的基因編輯技術(shù)已經(jīng)在一些研究中被用于克服這些障礙。在這里，小編為大家插播一項1月9日發(fā)表在Nature Medicine雜志上題為“Donor CD19 CAR T cells exert potent graft-versus-lymphoma activity with diminished graft-versus-host activity”的研究。由美國紀念斯隆凱特林癌癥中心的科學(xué)家領(lǐng)導的研究小組發(fā)現，同種異體供體CD19特異性的CD28z-CAR-T細胞在促進(jìn)抗淋巴瘤活性的同時(shí)，所導致的GVHD發(fā)生的風(fēng)險是最少的?！?a target="_blank">詳細】
除了用于產(chǎn)生“off-the-shelf”版本的CAR-T細胞，基因組編輯技術(shù)還可以通過(guò)敲除編碼T細胞抑制性受體或信號分子的基因（如CTLA4、PD1）提高CAR-T細胞的功效。在這部分內容中，作者們提到了美國NIH下屬Recombinant DNA Advisory Committee批準的將由CAR-T大牛Carl June教授領(lǐng)導的一項CRISPR臨床試驗。在該試驗中，研究人員將利用Cas9在黑色素瘤靶向的CAR-T細胞中敲除編碼PD-1的基因以及內源性T細胞受體的基因。此前，據Nature Biotechnology雜志報道，研究團隊計劃在今年第一季度開(kāi)始I期臨床試驗?！?a target="_blank">詳細】
這里也為大家插播一項Carl June教授去年11月在Clinical Cancer Research雜志上發(fā)表一篇論文（Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition）。研究證實(shí)，體外和動(dòng)物模型研究中，CRISPR基因編輯CAR-T細胞表現出了強有力的抗腫瘤活性。TCR和I類(lèi)HLA雙重缺陷的T細胞同種異體反應性（alloreactivity）降低，且沒(méi)有導致GVHD。此外，同時(shí)三重基因組編輯（增加了對PD-1基因的編輯）增強了CAR-T細胞的體內抗腫瘤活性。
該綜述也提到了由我國四川大學(xué)華西醫院腫瘤學(xué)家盧鈾教授研究小組率先開(kāi)展的全球首個(gè)CRISPR–Cas臨床試驗。雖然這一試驗沒(méi)有引入CAR，但利用Cas9敲除了來(lái)自肺癌患者T細胞的PD-1。一些類(lèi)似的用PD-1敲除T細胞（PD1-knockout T cells）治療前列腺癌、膀胱癌和腎細胞癌的試驗也在啟動(dòng)中。
與ZFNs 和TALENs等其它基因編輯技術(shù)相比，CRISPR–Cas能夠極快地測試任何新提出的基因改造。目前，CAR-T療法開(kāi)發(fā)者與專(zhuān)門(mén)從事基因編輯的公司之間已建立了大量的合作，其中包括Novartis與Intellia Therapeutics 和 Caribou Biosciences、Juno Therapeutics與Editas Medicine。此外，致力于異體CAR-T療法開(kāi)發(fā)的Cellectis公司從明尼蘇達大學(xué)獲得了一項使用TALENs的許可。
作者們表示，未來(lái)的CAR-T療法將受益于內源性T細胞受體基因、組織相容性基因以及信號通路組成的聯(lián)合改造。不過(guò)，需要注意的一點(diǎn)是，通過(guò)刪除這些抑制性信號提高CAR-T活性的同時(shí)，也要保證CAR-T細胞不會(huì )失控增殖。
體外基因編輯治療
文章還指出，造血系統是體外基因編輯的最佳目標。因為所需細胞可以從外周血樣本中快速獲得，且能夠在被改造和擴增后進(jìn)行回輸。作者們在該部分中介紹了一些基于造血干細胞基因編輯治療HIV的研究進(jìn)展。
第四部分：關(guān)于臨床
談及基因編輯技術(shù)的臨床之路，作者們稱(chēng)，體外研究和動(dòng)物模型預測基因編輯療法在人類(lèi)中副作用風(fēng)險的能力一直備受矚目。最終，患者、醫生和監管機構必須討論在每個(gè)情況下可接受的風(fēng)險等級，并開(kāi)發(fā)適當的安全措施。
結論
CRISPR–Cas工具已被用于許多先前基因操作相對棘手的細胞和有機體中。尤其在哺乳動(dòng)物模型系統和人類(lèi)細胞中，這些技術(shù)能夠加速功能基因組學(xué)揭示細胞機制，鑒定或驗證新的藥物靶點(diǎn)。利用CRISPR–Cas編輯動(dòng)物將產(chǎn)生人類(lèi)疾病更好的模型，更具預測性的安全性測試，并改善患者的分層以及治療方案。此外，基因編輯技術(shù)的發(fā)展也有望幫助產(chǎn)生創(chuàng )新的療法，包括癌癥T細胞療法、重編程iPSCs療法。作者們稱(chēng)：“我們相信，基因編輯已經(jīng)準備好對實(shí)際的藥物開(kāi)發(fā)產(chǎn)生直接的影響?！盋RISPR-Cas將成為下一代轉化療法（Transformational Therapies）和治療模式的關(guān)鍵。
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