高考要求
實(shí) 驗
要 求
（1）DNA粗提取與鑒定
（2）PCR技術(shù)的基本操作和應用
（3）蛋白質(zhì)的提取和分離
掌握程度參考本考試大綱中的：
一、考核目標與要求
2．實(shí)驗與探究能力
知識整合
1.DNA與蛋白質(zhì)提取分離與鑒定比較
比較項目
DNA粗提取與鑒定
血紅蛋白的提取和分離
實(shí)驗方法
鹽析法、酒精沉淀法和顯色法
凝膠色譜法和電泳法
實(shí)驗原理
1.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同（如圖）：
在2mol/LNaCl溶液中，DNA溶解，部分蛋白質(zhì)鹽析生成沉淀，過(guò)濾可除去部分蛋白質(zhì)；在0.14mol/LNaCl溶液中時(shí)，DNA析出，過(guò)濾可除去部分蛋白質(zhì)。
2.DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理可將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。
3.利用DNA遇二苯胺（沸水?。┏伤{色的特性，可以鑒定提取的DNA
1. 凝膠色譜法是根據相對分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內部，通過(guò)的路程短，移動(dòng)速度快；相對分子質(zhì)量小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內的通道，通過(guò)的路程長(cháng)，移動(dòng)速度慢。因此，樣品中相對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)先流出，相對分子質(zhì)量小的分子后流出。因此得以分離。
2. 電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個(gè)特定的pH下會(huì )帶上正電或負電；在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì )向著(zhù)與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達到對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的的。
實(shí)驗步驟
1.實(shí)驗材料的選取
一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì )由于實(shí)驗過(guò)程中或多或少的損失而造成檢測的困難。實(shí)驗中一般選用雞血或菜花作為實(shí)驗材料，不選擇哺乳動(dòng)物的血細胞，因為其紅細胞無(wú)核，很難提取到DNA。
2.破碎細胞，獲取含DNA的濾液
以動(dòng)物細胞為實(shí)驗材料時(shí)，破碎細胞較容易，例如，在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可。以植物細胞為材料時(shí)，充分研磨破壞了細胞壁，洗滌劑中的表面活性劑成分能夠與膜蛋白結合從而破壞細胞膜，這些為核DNA的釋放提供了通道。同時(shí)要加入食鹽使DNA溶解，便于提取。
3.去除濾液中的雜質(zhì)
根據DNA的溶解特性、對酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開(kāi)。
（1）利用DNA在不同NaCl溶液中溶解度不同，通過(guò)控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)。
（2）直接在濾液中加入嫩肉粉，使嫩肉粉中的木瓜蛋白酶分解蛋白質(zhì)。
（3）將濾液放入60℃～75℃的恒溫水浴箱中保溫10～15min，注意嚴格控制溫度。
4.DNA的析出與鑒定
在濾液中加入冷卻的無(wú)水乙醇，并用玻璃棒沿一個(gè)方向輕輕攪拌，由于 DNA不溶于酒精，會(huì )出現乳白色絲狀物，用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸去表面的水分。
兩支試管中各加入2mol/L的NaCl溶液5mL，將絲狀物放入其中一支試管中，攪拌使其充分溶解后，向兩支試管中分別加入4mL 二苯胺試劑，混勻后沸水溶中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩試管的顏色變化，將發(fā)現加入DNA的試管中的溶液呈藍色，從而鑒定DNA的存在。
血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。
1.樣品處理
（1）紅細胞的洗滌。洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白。采用低速短時(shí)間離心，吸出上層透明的黃色液體，再加入五倍體積的生理鹽水，重復洗滌三次，直至上清液中沒(méi)有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。
（2）血紅蛋白的釋放。紅細胞在蒸餾水和40%的甲苯作用下破裂，釋放血紅蛋白。（3）分離血紅蛋白溶液。將混合液進(jìn)行離心后會(huì )分層，第3層的紅色透明液體是血紅蛋白。
2.粗分離——透析 目的是除去樣品中的分子量較小的雜質(zhì)。
3.純化——凝膠色譜操作
（1）凝膠色譜柱的制作
（2）凝膠色譜柱的裝填
①裝填前，凝膠用蒸餾水或者洗脫液充分溶脹。
②凝膠裝填要均勻，色譜柱內不能有氣泡，一旦發(fā)現有，必須重裝。
③裝填完后，立即用300 ml 20 mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12 h，使凝膠裝填緊密。
（3）樣品的加入和洗脫
①按正確方法加樣，不能破壞凝膠面。
②進(jìn)行洗脫時(shí)，等紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，采用試管收集。
4.純度鑒定——SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(選做)
SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量,是根據大多數蛋白質(zhì)都能與陽(yáng)離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結合成復合物,使蛋白質(zhì)分子所帶的負電荷遠遠超過(guò)天然蛋白質(zhì)分子的負電荷，消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應,使蛋白質(zhì)分子相對遷移率的大小完全取決于分子量的高低，因此可從已知分子量的標準蛋白質(zhì)的對數和相對遷移率所作的標準曲線(xiàn)中求出供試品的分子量。
操作關(guān)鍵
（1）制備雞血細胞液時(shí)，要在取新鮮雞血的同時(shí)加入抗凝劑，使血液分層，取下層血細胞沉淀。
（2）獲取較多DNA的關(guān)鍵是向雞血細胞液加入足量的蒸餾水，以便使細胞膜和核膜破裂，核內物質(zhì)釋放出來(lái)。
（3）實(shí)驗中共有3次過(guò)濾。過(guò)濾時(shí)使用的紗布層數與取其濾液或黏稠物有關(guān)。第1、3次要取其濾液，使用的紗布為1—2層，第2次是要取其濾出的黏稠物，使用的紗布為多層。
（4）實(shí)驗中有6次攪拌，除最后一次攪拌外，前5次攪拌要朝向一個(gè)方向，并且在析出DNA，DNA再溶解和提取中，各步攪拌都要輕緩，玻璃棒不要直插燒杯底部，防止DNA分子斷裂。
（5）實(shí)驗中有兩次使用蒸餾水。一次在第1步，加水是為了使血細胞吸水膨脹破裂，加水后必須充分攪拌，不應少于5min，使血細胞充分破裂；第二次加蒸餾水是在第3步，加水是為了稀釋氯化鈉溶液。
（6）實(shí)驗中有三次加氯化鈉溶液。在步驟2中，當加入氯化鈉后，必須充分晃動(dòng)燒杯，使二者混合均勻，加速染色質(zhì)中DNA與蛋白質(zhì)分離，使DNA充分游離，并溶解在氯化鈉溶液中。在步驟5中，加氯化鈉溶液也是為了DNA的再溶解，不過(guò)這時(shí)溶液中蛋白質(zhì)含量已很少。在步驟8中，加的NaCl溶液的濃度比前2次低的多，但還是為溶解DNA。
（7）DNA進(jìn)一步提純時(shí)選用預冷95%的酒精作用是抑制核酸水解酶活性，防止DNA講解；降低分子運動(dòng)，易于形成沉淀；低溫有利于增加DNA柔韌性，減少斷裂。
（8）本實(shí)驗成功的關(guān)鍵，是保證提取到足量且較純凈的DNA。因為DNA在細胞中含量少，所以在下列步驟中應特別注意：在步驟1中使用的雞血的量要在180mL左右。提取細胞核物質(zhì)時(shí)要充分攪拌5min以上。在步驟2中要充分晃動(dòng)燒杯，在步驟3中加蒸餾水要控制好量，同時(shí)應用玻璃棒緩緩攪動(dòng)使DNA聚集其上。在第4步中要使用多層紗布過(guò)濾，在第5步中要充分攪伴，在第7步中使用冷酒精。因為DNA易吸附在玻璃容器上，所以實(shí)驗中最好使用塑料燒杯和試管，以減少DNA的損失。
（9）盛放雞血細胞液的容器和實(shí)驗中的燒杯和試管最好也是塑料制的，因為玻璃制品表面帶電荷，DNA中的磷酸基帶相反的電荷，會(huì )被吸附于玻璃表面，減少DNA含量。
（10）二苯胺實(shí)際要現用現配，否則會(huì )影響鑒定效果。
1.洗滌紅細胞時(shí)，洗滌次數過(guò)少，無(wú)法去除血漿蛋白；離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)高會(huì )使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，達不到分離的效果。
2.商品凝膠是干燥的顆粒，使用前需要放在洗脫液中膨脹，為了加速膨脹，可以加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，逐漸升溫接近至沸騰，通常需1～2h。這種方法不但節約時(shí)間，而且可以除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內空氣。
3.凝膠色譜柱的裝填是分離關(guān)鍵之一，裝填時(shí)要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。裝填時(shí)不能有氣泡，氣泡會(huì )攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。裝填后不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象。一旦出現上述現象都需重填。如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話(huà)，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區帶均勻、狹窄、平整，隨著(zhù)洗脫液緩慢流出；如果紅色區帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。
4.分離蛋白質(zhì)時(shí)，要求各種蛋白質(zhì)同時(shí)從相同起點(diǎn)開(kāi)始分離，在凝膠色譜操作中加樣時(shí)要保證分離樣品進(jìn)入凝膠層后再接通洗脫液，開(kāi)始洗脫。在電泳操作中，通過(guò)濃縮膠的作用，將樣品濃縮后再進(jìn)入分離膠分離。
5.滴加樣品時(shí)，吸管關(guān)口貼管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。
2.細胞內DNA復制與PCR技術(shù)的比較
比較項目
體內復制
PCR反應
解旋
在解旋酶作用下，細胞提供能量，部分DNA雙鏈解開(kāi)
80～100℃高溫解旋DNA雙鏈全部解開(kāi)，不需要解旋酶
酶
DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶
TaqDNA聚合酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或單鏈DNA分子片段
合成子鏈
在引物基礎上，一條鏈連續合成；另一條鏈不連續合成。再由DNA連接酶連接
分別從兩條鏈的引物端開(kāi)始，都是連續合成
溫度
體內溫和條件
高溫
特點(diǎn)
邊解旋邊復制 半保留復制
體外快速擴增
循環(huán)次數
受生物體自身控制
30多次
產(chǎn)物
完整DNA
引物之間DNA片段
相同點(diǎn)
都需要提供DNA模板；以4種脫氧核苷酸(dNTP)為原料；都需要在一定緩沖溶液中進(jìn)行；子鏈延伸的方向都是從5′→3′方向
3.PCR操作
項目
PCR操作
用具
微量離心管、微量移液器、DNA擴增儀（熱循環(huán)儀）、臺式高速離心機 、一次性槍頭、紫外分光光度計
步驟
（1）準備：按照PCR反應體系配方將所需試劑擺放到實(shí)驗桌上
（2）移液：用微量移液器按照配方在微量離心管加入各組分
（3）混合：蓋嚴離心管蓋子，防止脫落或液體外濺，并用手指輕彈管壁，使反應液混合均勻。
（4）離心：將微量離心管放在離心機上，離心約10s，目的使反應液集中在離心管底部，提高反應效率。
（5）反應：將離心管放入PCR儀中，設置程序進(jìn)行反應。
（6）測定：用紫外光光度計測定DNA在260nm紫外線(xiàn)的光吸收值，計算DNA的含量。
過(guò)程
其原理與細胞內DNA復制相似,但反應體系較簡(jiǎn)單，其基本過(guò)程為：①變性：通過(guò)加熱至95℃左右，使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，作為反應的模板。②退火（復性）：將溫度降至引物的50℃左右或以下，引物與DNA模扳互補區域結合，形成雜交鏈。③延伸： 當反應體系溫度升至72℃左右時(shí)，DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的5ˊ→3ˊDNA鏈延伸反應，形成新生DNA鏈。以上三步為一個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板,如此循環(huán)30次，介于兩個(gè)引物之間的DNA片段呈指數擴增。
結果
(1)DNA擴增的理論數值
①開(kāi)始有1條模板，則復制n次有2n條
②開(kāi)始有m條模板，則復制n次有m×2n條
（2）計算DNA含量。公式：DNA含量(
g)=50×（260nm的讀數）×稀釋倍數。
成功關(guān)鍵
（1）為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓蒸氣滅菌。
（2）在微量離心管中添加反應成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。所有的成分都加入后，蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管的側壁，使反應液混合均勻，再將微量離心臂放在離心機上，離心約10s，使反應液集中在離心管底部，再放入PCR儀中 進(jìn)行反應。
有關(guān)問(wèn)題
1.DNA復制需要引物的原因：DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能從
3′端延伸DNA鏈。
2.當PCR體系的溫度有變性后快速冷卻到50℃左右時(shí)，引物與模板可結合，一般不需考慮解開(kāi)的兩個(gè)DNA鏈的重新結合，原因是：
（1）模板DNA比引物長(cháng)得多，而且復雜得多，不易重新結合。
（2）引物和模板之間的碰撞機會(huì )遠遠高于模板互補鏈之間碰撞。
（3）加入的引物的量足夠大而模板鏈數量少。
