Biospin質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒檢測
一、基礎知識
質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現于細菌、放線(xiàn)菌和真菌細胞中,它具有自主復制和轉錄能力,能在子代細胞中保持恒定的拷貝數,并表達所攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒的復制和轉錄要依賴(lài)于宿主細胞編碼的某些酶和蛋白質(zhì),如離開(kāi)宿主細胞則不能存活,而宿主即使沒(méi)有它們也可以正常存活。
二、實(shí)驗目的
1，掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。
2，檢測該商品是否合格。
三、實(shí)驗原理
從細菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟:培養細菌使質(zhì)粒擴增→收集和裂解細胞→分離和純化質(zhì)粒DNA。
采用溶菌酶可以破壞菌體細胞壁,十二烷基磺酸鈉(SDS)和Triton X-100可使細胞膜裂解。
經(jīng)溶菌酶和SDS或Triton X-100處理后,細菌染色體DNA會(huì )纏繞附著(zhù)在細胞碎片上,同時(shí)由于細菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,易受機械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線(xiàn)性片段。當用強熱或酸、堿處理時(shí),細菌的線(xiàn)性染色體DNA變性,而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(Covalently closed circular DNA,簡(jiǎn)稱(chēng)cccDNA)的兩條鏈不會(huì )相互分開(kāi),當外界條件恢復正常時(shí),線(xiàn)狀染色體DNA片段難以復性,而是與變性的蛋白質(zhì)和細胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒DNA雙鏈又恢復原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。
在細菌細胞內,共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過(guò)程中,除了超螺旋DNA外,還會(huì )產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱(chēng)開(kāi)環(huán)DNA(Open circular DNA, 簡(jiǎn)稱(chēng) ocDNA)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線(xiàn)狀DNA(Linear DNA)。當提取的質(zhì)粒DNA電泳時(shí),同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開(kāi)環(huán)和線(xiàn)狀分子的泳動(dòng)速度快。
四、材料、設備及試劑
材料：1—1.5ml過(guò)夜培養的E.coli菌液、1.5ml離心管、離心管架、手套、
Spin column、中槍頭、大槍頭、平板紙
設備：20—200ul的移液器、100—1000ul的移液器、臺式高速離心機、渦旋振蕩器, 電泳儀,瓊脂糖平板電泳裝置、恒溫水浴鍋等
試劑：RNA酶溶液、Resuspension Buffer、細胞Lysis Buffer、Neutralization Buffer、Wash Buffer、無(wú)水乙醇、Elution Buffer、取離子水或TE溶液
五、 實(shí)驗步驟
（一）質(zhì)粒提取
(培養大腸桿菌)→收集菌體→重懸菌體→裂解細胞→沉淀除雜→離心初步純化→膜過(guò)濾純化→洗脫收集質(zhì)粒DNA
1，將1ml過(guò)夜培養的細菌菌液加入1.5ml離心管中
2，
3，加250ul Resuspension Buffer,劇烈振蕩，使菌體沉淀重新懸浮至沒(méi)有細菌團塊，加RNA酶溶液，2—
4，加250ul細胞Lysis Buffer，輕柔顛倒4—6次，冰浴5分鐘（不要劇烈振動(dòng)，以防止基因組DNA被剪切。反應不超過(guò)5分鐘）
5，加350ul預冷的Neutralization Buffer，立即輕柔顛倒離心管4—6次，冰浴中5-10分鐘（溶液應該出現絮狀物，但不會(huì )出現局部沉淀）
6，
7，將上清液轉移到Spin column內，
8，按Wash Buffer瓶身標簽標明體積加入無(wú)水乙醇，并將其混勻
9，向Spin column內加650ul Wash Buffer，
10，重復第9步
11，
12，向Spin column內加50ul Elution Buffer、去離子水或TE溶液，并于室溫靜置1分鐘（洗脫液體積可根據實(shí)驗的實(shí)際需要決定）
13，
（二）質(zhì)粒檢測
1，瓊脂糖電泳檢測（0.8—1﹪ Agarose gel）：質(zhì)粒電泳一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開(kāi)環(huán)、線(xiàn)型三種構型
2，吸光值檢測:采用分光光度計檢測260nm、280nm、320nm波長(cháng)吸光值，
濃度（ug/ml）=50×OD 260nm×稀釋后的體積
目標 2.0≧OD 260-320nm/ OD 280-320nm≧1.8
1.0≧OD 260nm≧0.1,the result of ratio is much reliable
若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之間，說(shuō)明質(zhì)粒質(zhì)量較好，1.8為最佳，低于1.8說(shuō)明有蛋白質(zhì)污染，大于1.8說(shuō)明有RNA污染
六、 注意事項
1，實(shí)驗前檢查細胞Lysis Buffer、Neutralization Buffer是否有沉淀，如果有沉淀用37℃溫浴溶解
2，不要劇烈搖晃Lysis Buffer
3，提取過(guò)程應盡量保持低溫
七、 常見(jiàn)問(wèn)題及對策
1，沒(méi)有提取到質(zhì)粒
如在洗脫后，發(fā)現溶液中沒(méi)有質(zhì)粒DNA，請檢查是否按Wash Buffer瓶身標簽標明的體積加入了無(wú)水乙醇
2，質(zhì)粒提取率低
① 請先確認培養的細菌，配出培養過(guò)程中的雜菌污染、質(zhì)粒丟失等原因
② 加入重懸也后應使菌體沉淀充分懸浮分散
③ 在洗脫前將Elution Buffer于30—60℃溫育，可提高提取效率
3，吸光度測量結果問(wèn)題
① 吸光度測量的是未知樣品與調零標準之間的相對吸光度，所以請用與洗脫液體相同的液體，對測量樣品進(jìn)行稀釋和調零
② OD 260nm/280nm的比值偏低，可用Wash Buffer多一次對離心柱進(jìn)行洗滌
③ 如OD 260-320nm/ OD 280-320nm的比值偏低，說(shuō)明有蛋白質(zhì)污染。應在加入Neutralization Buffer后，以足夠高的轉速離心，使沉淀緊密，并小心地吸取上清液，避免吸入沉淀
④ 如OD 260-320nm/ OD 280-320nm的比值偏高，說(shuō)明有RNA污染，請在重懸液中加入RNase A至終濃度100ug/ml
4，電泳結果問(wèn)題
① 有基因組條帶。在加入Lysis Buffer、Neutralization Buffer后，顛倒離心管應柔和，以避免基因組DNA收到剪切
② 有RNA污染。請在重懸液中加入RNase A至終濃度100ug/ml
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