在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，細菌核糖體與信使RNA結合，圖為該復合體的分子模型
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隨著(zhù)科學(xué)家對RNA化學(xué)修飾研究的深入，表觀(guān)轉錄組學(xué)的研究工具進(jìn)一步增加。
【【科學(xué)之美】RNA化學(xué)修飾成為研究焦點(diǎn)】http://toutiao.com/group/6415523095960289537/?iid=15906422033&app=explore_article×tamp=1520010937&tt_from=copy_link&utm_source=copy_link&utm_medium=toutiao_ios&utm_campaign=client_share
2004年，以色列特拉維夫大學(xué)的腫瘤學(xué)家吉迪恩·雷肖比（Gideon Rechavi）和同事們比較了所有人類(lèi)基因組DNA序列和對應的信使RNA序列，信使RNA（mRNA）攜帶著(zhù)基因制造蛋白質(zhì)的所需信息。他們正在尋找一種改變，組成RNA序列的一種核苷酸組件——腺嘌呤核苷（簡(jiǎn)稱(chēng)A）被換成了另一種標準組件——次黃嘌呤核苷（簡(jiǎn)稱(chēng)I）。這種“A到I的變化”會(huì )改變蛋白質(zhì)的編碼序列，在人類(lèi)發(fā)展史中，對于維持先天免疫應答至關(guān)重要?！拔覀兊墓ぷ髀?tīng)起來(lái)很簡(jiǎn)單，實(shí)際上非常復雜，”雷肖比回憶到，“已經(jīng)有不少研究小組嘗試過(guò)，但都失敗了?！本科湓?，主要是測序錯誤和單核苷酸突變使數據受到干擾。但是，利用新的生物信息學(xué)方法，雷肖比的團隊在轉錄組（生物體或細胞群體中所有的mRNA）中發(fā)現了上千個(gè)變化了的修飾位點(diǎn)，隨后又增加到了數百萬(wàn)個(gè)。
次黃嘌呤核苷多少有點(diǎn)特殊：通過(guò)比較DNA和RNA序列，研究人員能夠輕易地發(fā)現這種缺陷。不過(guò)，至少有1/4的mRNA帶著(zhù)化學(xué)標記，也就是組成RNA的A、C、G、U四種核苷酸被修飾過(guò)，但是目前的測序技術(shù)是無(wú)法發(fā)現的。（類(lèi)似的標記在DNA上也有，稱(chēng)為表觀(guān)遺傳學(xué)標記。）現在，科學(xué)家尚不清楚RNA上的化學(xué)修飾有何用途，還需要努力研究。
在過(guò)去5年中，科學(xué)界掀起了研究N6-甲基腺苷（m6A）的浪潮：在轉錄組中確定m6A的位點(diǎn)圖譜，并證明這一修飾對健康和疾病至關(guān)重要。不過(guò)，研究工作量巨大：在mRNA和其他RNA的轉錄產(chǎn)物上都有這一標記，而且幾乎所有物種內都有，甚至病毒也不例外。
核苷酸上的化學(xué)修飾本身并不是惹人注目的新發(fā)現。讓它走上前臺并讓表觀(guān)轉錄組學(xué)成為焦點(diǎn)的是一類(lèi)酶的發(fā)現，這些酶各自負責化學(xué)修飾的添加、去除或者是與化學(xué)修飾結合，發(fā)揮特殊作用。2010年，芝加哥大學(xué)的化學(xué)生物學(xué)家何川提出，化學(xué)標記是可逆的，對基因表達起著(zhù)重要調節作用。不多久，他的研究團隊就找到了第一個(gè)“橡皮擦”，這種名為FTO的酶能夠去除mRNA上的甲基標記。也就是說(shuō)，細胞能夠主動(dòng)地控制m6A。這個(gè)發(fā)現利用了新一代測序技術(shù)，能繪制出m6A和轉錄組中其他化學(xué)修飾的位點(diǎn)圖譜。
如今，表觀(guān)轉錄組學(xué)正在蓬勃發(fā)展，不過(guò)相關(guān)的工具卻還不完善。當前的方法缺乏靈敏度，不能用于檢測珍稀樣品?？茖W(xué)家既不能確定轉錄組中特定化學(xué)修飾的數量，也不能在單次實(shí)驗中繪制一種以上的化學(xué)修飾位點(diǎn)圖譜。芝加哥大學(xué)的分子生物學(xué)家潘濤與何川合作研究FTO，他表示：“目前我們亟需新技術(shù)來(lái)檢測各種RNA化學(xué)修飾?！?/p>
甲基化RNA二聚體
這就是說(shuō)，表觀(guān)轉錄組學(xué)的研究人員正在為他們的領(lǐng)域有了方向而歡欣鼓舞。美國威爾康奈爾醫學(xué)院的遺傳學(xué)家克里斯·梅森（Chris Mason）領(lǐng)導了繪制m6A位點(diǎn)圖譜的工作，他說(shuō)：“正如你想到DNA就會(huì )想到DNA的組裝和表觀(guān)遺傳學(xué)修飾一樣，我認為，在現在和未來(lái)，在提到RNA時(shí)，沒(méi)有人會(huì )不想到'如何修飾’這個(gè)問(wèn)題?！?/p>
利用抗體繪制修飾位點(diǎn)圖譜
早在20世紀70年代，科學(xué)家就利用m6A上的放射性同位素標記第一次證明了mRNA存在化學(xué)修飾。但是，這個(gè)研究原理是，mRNA轉錄物的3′末端含有一串腺嘌呤核苷，以此選擇性富集mRNA轉錄物，研究人員擔心，這些標本可能含有痕量的其他類(lèi)別的RNA分子。威爾康奈爾醫學(xué)院的化學(xué)生物學(xué)家薩米·賈弗里（Samie Jaffrey）說(shuō)：“人們停止了這方面的研究，因為太難判斷，mRNA中的m6A到底是不是污染物?！?/p>
同樣困難的是弄清轉錄組中m6A位于何處，這有助于理解m6A的功能。常規的測序方法需要逆轉錄——把RNA轉換成互補DNA（cDNA）——然后擴增、測序。問(wèn)題在于制備cDNA的逆轉錄酶經(jīng)常會(huì )把化學(xué)修飾除去。賈弗里指出：“那樣就不可能看見(jiàn)m6A了，逆轉錄以后，它就像個(gè)普通的A一樣了?！?/p>
雖然存在技術(shù)難題，但是科學(xué)家意外地發(fā)現了一種細菌RNA的化學(xué)修飾，這引起了賈弗里的興趣，他準備在哺乳動(dòng)物的RNA中尋找這種修飾。他與梅森合作，研究小組把RNA切割成小段，用抗體分離出包含有m6A的部分，然后進(jìn)行測序?！拔覀兦宄乜匆?jiàn)mRNA的標簽，非常顯眼。那絕不是污染?！辟Z弗里說(shuō)。雷肖比的團隊也進(jìn)行了類(lèi)似研究，發(fā)現了大量的m6A，在7 000個(gè)人類(lèi)基因上有12 000個(gè)位點(diǎn)。該團隊還發(fā)現，這種修飾常常集中出現在外顯子和終止密碼子中，前者是蛋白質(zhì)編碼區，后者是mRNA中代表蛋白質(zhì)編碼序列結束的3個(gè)密碼子。
上述研究人員采用的方法是m6A-seq和MeRIP-seq，已經(jīng)廣泛應用于繪制不同疾病背景和生物體中的m6A位點(diǎn)圖譜。針對m6A的抗體和試劑都可以在網(wǎng)上獲取。研究人員認為，這種化學(xué)修飾控制著(zhù)細胞發(fā)育成不同類(lèi)型的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程一旦異常就會(huì )導致癌癥。實(shí)際上，表觀(guān)轉錄組與癌癥的第一個(gè)聯(lián)系已經(jīng)被發(fā)現。何川的團隊證實(shí)，在某些急性髓細胞白血病病例中，存在遠高于正常水平的FTO酶，將刺激細胞分化的轉錄產(chǎn)物上的m6A除去。
與此同時(shí)，另一個(gè)研究小組對何川團隊的成果進(jìn)行了不同的解釋。使用分辨度更高的新一代抗體做圖法（miCLIP），賈弗里的團隊證實(shí)m6A的抗體也能與N6, 2′-O-二甲基腺苷（m6Am）結合，這是對mRNA 5′末端化學(xué)結構的修飾。當時(shí)，賈弗里并不知道m6Am究竟有什么生物學(xué)意義。但是，他的團隊發(fā)現m6Am（不是m6A）是FTO清除作用的主要目標，它會(huì )影響mRNA的穩定性和亞細胞定位。對于賈弗里來(lái)說(shuō)，何川團隊之前的研究成果將FTO與急性髓細胞白血病關(guān)聯(lián)起來(lái)，正說(shuō)明m6Am（不是m6A）與癌癥的起源和發(fā)展有不可忽視的關(guān)系。
癌癥生物學(xué)家霍華德·張
斯坦福大學(xué)的癌癥生物學(xué)家霍華德·張（Howard Chang）指出，這種差異在新興領(lǐng)域是常有的事?！斑@一特殊問(wèn)題與早期研究組蛋白化學(xué)修飾時(shí)遇到的問(wèn)題并沒(méi)有什么不同?！彼e例說(shuō)明，DNA被緊緊包裹在細胞中，而經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的組蛋白在DNA周?chē)?/p>
更多化學(xué)修飾
RNA上的其他化學(xué)修飾同樣吸引著(zhù)科學(xué)家們的注意。2016年，北京大學(xué)的化學(xué)家伊成器的研究團隊和雷肖比、何川的團隊都利用抗體在小鼠和人類(lèi)細胞系中找到了N1-甲基腺苷（m1A）。兩個(gè)研究小組用不同的方法保護m1A不被逆轉錄干擾，他們的研究都證實(shí)，早在20世紀60年代就在總RNA中發(fā)現的m1A位于mRNA開(kāi)始生產(chǎn)蛋白質(zhì)的位點(diǎn)上。壓力條件改變可化學(xué)修飾的位點(diǎn)，說(shuō)明它們是動(dòng)態(tài)的。
關(guān)于m1A的作用，目前科學(xué)家們還不得而知，不過(guò)他們有一個(gè)令人向往的線(xiàn)索：大多數轉錄產(chǎn)物只有一個(gè)m1A位點(diǎn)，這樣的產(chǎn)物翻譯成蛋白質(zhì)的概率比那些缺乏修飾的更頻繁?！斑@是令人興奮的現象，當然也是復雜的，我們正在研究一種新的mRNA翻譯調節機制?！崩仔け日f(shuō)。
其他整體位點(diǎn)圖譜方法依賴(lài)于這樣的事實(shí)，有些RNA化學(xué)修飾充當了附加化學(xué)標記的手柄。2011年末，伊成器組建了實(shí)驗室，當時(shí)假尿苷（pseudouridines或pseudoU）在許多種類(lèi)的RNA中都發(fā)現了，唯獨mRNA中沒(méi)有。2015年，他的團隊描述了一種化學(xué)標簽和拉下（pulldown）方法用于富集轉錄產(chǎn)物上的修飾。出乎他的意料，pseudoUs在小鼠和人類(lèi)的mRNA中含量比預想的要豐富得多。于是他的工作重點(diǎn)就轉移到研究這個(gè)標記的功能?！拔艺J為，pseudoU在mRNA中有多重作用，這取決于何時(shí)、何地、如何安裝和調控RNA的轉錄?！币脸善髡f(shuō)。他補充說(shuō)，我目前已經(jīng)知道，這些pseudoU是化學(xué)標記的“寫(xiě)入者”，是否也是“閱讀者”和“清除者”呢？仍然懸而未決。
圖譜技術(shù)的進(jìn)展
無(wú)論是用抗體還是化學(xué)方法，繪制RNA化學(xué)修飾位點(diǎn)圖譜都是一項棘手的任務(wù)。梅森指出，抗體會(huì )與其他化學(xué)修飾交叉反應，所有研究人員要用至少兩種不同抗體對結果做互相關(guān)（cross-correlate）分析。與其他方法相比，化學(xué)方法能切斷、結合或者富集某些區域，對其他區域的檢測效果卻不盡人意。伊成器說(shuō)，測序深度和生物信息學(xué)算法選擇也會(huì )影響修飾位點(diǎn)的檢測。甚至，細胞在培養中保持活性的時(shí)間長(cháng)短都會(huì )影響修飾水平，梅森說(shuō)，所以，找到圖譜基線(xiàn)對于對照至關(guān)重要。
但是無(wú)論如何，僅僅顯示樣品中含有特定的化學(xué)修飾還不夠。相反，對所有的RNA化學(xué)修飾進(jìn)行定量是至關(guān)緊要的，因為細胞可能就是依賴(lài)某個(gè)化學(xué)修飾的正確數量來(lái)發(fā)揮正常功能，潘濤說(shuō)道。有些研究者想通過(guò)增強寫(xiě)入和擦除酶來(lái)調整修飾水平，因此定量對他們來(lái)說(shuō)尤其重要。僅僅存在這樣的酶就可以表明，精確調整修飾水平是重要的。
2015年，潘濤的團隊描述了一種量化化學(xué)修飾的有效方法，至少在一種名為“轉移RNAs”的RNA上是有效的。具體方法是：用逆轉錄酶讀取各種化學(xué)修飾，從而獲取第一個(gè)化學(xué)修飾下游的序列。目前，潘濤表示，他的小組正在把同樣的技術(shù)運用到如m1A等mRNA化學(xué)修飾上。
不過(guò)，也許確定功能最快的方法是識別這些標簽的“閱讀者”、“寫(xiě)入者”和“清除者”。2012年，雷肖比團隊進(jìn)行了m6A-位點(diǎn)圖譜研究，創(chuàng )造了大量帶有或不帶有m6A化學(xué)修飾的RNA短片段，以它們?yōu)檎T餌釣出了與RNA結合的蛋白質(zhì)。2014年，他的團隊采用類(lèi)似的策略發(fā)現了一些m6A的“閱讀者”。其他研究也推斷出與此不同的細胞功能?，F在，雷肖比打算用同樣的誘餌法把m1A的“閱讀者”也釣出來(lái)，雖然這可能會(huì )更困難，因為m1A集中的位點(diǎn)（就是蛋白質(zhì)的翻譯起始點(diǎn)）結構比m6A的序列更復雜。
一旦確定某個(gè)酶是某個(gè)化學(xué)修飾的“閱讀者”，基因編輯技術(shù)就可以輕易調節蛋白的表達，讓研究人員從細胞的總體改變中探明化學(xué)修飾作用。例如，霍華德的一項研究除掉了m6A的一個(gè)“閱讀者”酶，以此證明了這種化學(xué)修飾在決定細胞命運時(shí)的重要性。
但是如同所有的后天獲得的性狀一樣，解釋這些發(fā)現非常復雜，比如同樣的酶可能與大量不同的RNA作用，一種化學(xué)修飾也可能在不同的RNA中有不同的作用，霍華德指出：“如果通過(guò)研究其他物種的RNA而取得突破，而不是人的RNA，我一點(diǎn)也不會(huì )驚訝?；瘜W(xué)修飾在細胞中大量存在且十分重要?！?/p>
更多研究工具
近年來(lái)，何川的團隊發(fā)現，RNA化學(xué)修飾提供了一種調控轉錄產(chǎn)物的方法，在不少細胞功能中發(fā)揮作用，比如開(kāi)啟細胞分化的過(guò)程。研究人員需要更好的技術(shù)來(lái)探究它們之間的聯(lián)系，于是，2016年10月，美國國立衛生研究院（NIH）決定，給予何川和潘濤5年時(shí)間、投入1 060萬(wàn)美元，建立一個(gè)技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，為識別和繪制RNA化學(xué)修飾位點(diǎn)圖譜服務(wù)。何川表示，最大的關(guān)注點(diǎn)是想出能在修飾位點(diǎn)上產(chǎn)生突變并能擴增的方法。
借助新的成像技術(shù)，今后科學(xué)家可能對特定轉錄產(chǎn)物上的某個(gè)化學(xué)修飾做圖像分析?！拔叶嗝纯释腥四馨l(fā)明一種技術(shù)，讓我看到mRNA上的m6A修飾?！焙未ㄕf(shuō)，不過(guò)，現在還是不可能的。傅燕是他以前的研究生，目前正在哈佛大學(xué)生物物理學(xué)家莊小威的實(shí)驗室中工作。傅燕把超分辨率顯微鏡與莊小威開(kāi)創(chuàng )的單細胞RNA MERFISH成像結合。傅燕說(shuō)，自己在過(guò)去兩年中取得了進(jìn)展，但是數據有干擾，需要進(jìn)一步優(yōu)化條件，以便更有效地檢測出化學(xué)修飾。
電子顯微照片，RNA聚合酶分子與DNA鏈的特異連接物
另一些研究人員正在設法避開(kāi)傳統RNA測序中的問(wèn)題。英國牛津納米孔公司(Oxford Nanopore Technologies)報告，他們延伸了RNA與線(xiàn)性DNA，讓其通過(guò)鑲嵌在膜中的納米孔。美國太平洋生物技術(shù)公司也宣布，運用該公司的單分子實(shí)時(shí)（SMRT）化學(xué)測序技術(shù)，他們能直接對RNA測序?！斑@個(gè)想法在SMRT研制時(shí)就有了?！惫镜氖紫萍脊賳碳{斯·庫爾賴(lài)斯（Jonas Korlach）說(shuō)。SMRT利用復制DNA鏈的DNA聚合酶，能夠實(shí)時(shí)觀(guān)察到熒光核苷酸聚合成DNA鏈。為了讓這些技術(shù)能用于RNA，庫爾賴(lài)斯、梅森和合作者用HIV中的逆轉錄酶取代了聚合酶。與DNA平臺一樣，修飾過(guò)堿基與未修飾堿基在聚合速率上截然不同，前者遠低于后者，從而讓每種修飾都具有了“動(dòng)力學(xué)特征”。
不過(guò)，技術(shù)上的障礙仍然存在，RNA結構本身比DNA更復雜。一是RNA容易自身折疊形成環(huán)和結等高級結構。在他們的研究中，牛津納米孔公司把RNA組裝到cDNA上，能“燙平”二級結構，讓RNA穿過(guò)小孔。二是RNA比DNA容易降解，妨礙長(cháng)時(shí)間的測序過(guò)程。
還有另一個(gè)挑戰存在于數據方面，那就是RNA化學(xué)修飾的數量。在同一個(gè)RNA分子中識別出多種不同的化學(xué)修飾需要大量的訓練集才能教會(huì )探測軟件辨別不同的化學(xué)修飾。溫斯頓·提姆普（Winston Timp）是約翰·霍普金斯大學(xué)的生物醫學(xué)工程師，他已經(jīng)利用牛津納米孔公司的技術(shù)開(kāi)發(fā)了新方法用于探測特殊的DNA修飾。他打算把這一技術(shù)應用到RNA上，開(kāi)發(fā)識別m6A修飾的訓練集?！皢?wèn)題是，我們不知道一個(gè)特定的分子上的化學(xué)修飾到底會(huì )有多么不同，但是那正是我們要研究的，這是令人興奮的研究領(lǐng)域！”他說(shuō)。
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