3.2點(diǎn)樣，上膠 分兩次吸取樣品，每次170ul,按從正極到負極的順序加入點(diǎn)樣槽兩側，再用鑷子撥開(kāi)Immobiline DryStrip gels(18cm，pH 3-10)膠條，從正極到負極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品雙向電泳實(shí)驗過(guò)程及相關(guān)溶液配置 A.實(shí)驗過(guò)程 一、實(shí)驗原理：2-DE的第一向電泳等電聚焦是基于等電點(diǎn)不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同，而將一向分離后的蛋白進(jìn)一步分離這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量的信息 二、實(shí)驗步驟： 1.樣品的溶解 取純化后的晶體蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白：100ul裂解液)振蕩器上振蕩10min左右，共處理一個(gè)小時(shí)其中每隔10~15分鐘振蕩一次，然后13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清分裝，每管70ul，-80oC保存 2.Bradford法測蛋白含量 取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超純水溶解,測定BSA標準曲線(xiàn)及樣品蛋白含量 取7個(gè)10ml的離心管，首先在5個(gè)離心管中按次序加入0ul,5ul,10ul,15ul,20ul的BSA溶解液，另2管中分別加入2ul的待測樣品溶液，再在每管中加入相應體積的雙蒸水(總體積為80ul)，然后，各管中分別加入4ml的Bradford液(原來(lái)配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過(guò)濾一遍方能使用)，搖勻，2min在595nm下，按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值，再測樣品OD值(測量過(guò)程要在一個(gè)小時(shí)內完成)例如： 編號蛋白量(ul)Buffer(ul)Bradford(ml)OD595值 1 080 40 25 75 40.024 310 70 40.061 415 65 40.091 520 60 40.116 Bt4 278 40.079 Bt4 476 4 轉Bt4 278 40.075 轉Bt4 476 4 標準曲線(xiàn)方程式：Y=aX b.其中Y為OD值，X為蛋白含量a、b通過(guò)作圖輸入數據可知 相關(guān)系數通過(guò)輸入數據，作圖，軟件分析可得 OD值測量過(guò)程： 比色皿用70%的乙醇保存，待用時(shí)用雙蒸水沖洗，再用無(wú)水乙醇沖洗，雙蒸水沖洗，再加入待測樣品溶液潤洗，然后，加入樣品，測定OD值 3.雙向電泳第一向---IEF(雙向電泳中一律使用超純水) 3.1水化液的制備 稱(chēng)取2.0mg的DTT，用700ul水化液儲液溶解后,加入8ul 0.05%的溴酚蘭，3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer(pH 3-10)振蕩混勻，13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清 在含300ug蛋白(經(jīng)驗值)的樣品溶解液中加入水化液，至終體積為340ul，振蕩器上振蕩混合,13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清注意：膠條使用前，要在室溫中平衡30分鐘；加樣時(shí)，正極要多加樣，以防氣泡的產(chǎn)生；壓膠時(shí)不能產(chǎn)生氣泡；酸性端對應正極，堿性端對應負極；樣品加好后，加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad)，兩個(gè)上樣槽必須與底線(xiàn)齊平 3.3 IPG聚焦系統跑膠程序的設定(跑膠溫度為20oC) S1(30v,12hr,360vhs,step) S2(500v,1hr,500vhs,step) S3(1000v,1hr,1000vhs,step) S4(8000v,0.5hr,2250vhs,Grad) S5(8000v,5hr,40000vhs,step)共計44110vhs,19.5小時(shí) 其中S1用于泡脹水化膠條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦 3.4平衡 用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后，在濾紙上吸干(膠面，即接觸樣品那一面不能接觸濾紙，如果為18cm的膠條要將兩頭剪去)，再以超純水沖洗，濾紙吸 |
聯(lián)系客服
