食品實(shí)驗室服務(wù)
一名合格的微生物實(shí)驗人員應該具備哪些知識和技能？如果你正在被一些微生物實(shí)驗問(wèn)題困擾著(zhù)，那么今天這個(gè)帖子你點(diǎn)開(kāi)就對了，“恍然大悟”、“茅塞頓開(kāi)”、“醍醐灌頂”到底有沒(méi)有用仔細看下就知道了。
一、無(wú)菌室的要求
二、樣品準備
三、培養基與試劑制備的制備和殺菌
四、微生物實(shí)驗操作
五、微生物實(shí)驗室廢棄物處理
六、實(shí)驗結果報告
七、實(shí)驗室設備的校準、維護和性能驗證
一. 微生物無(wú)菌室基本要求及管理
1.1.1 根據本實(shí)驗室所涉及的生物安全等級，無(wú)菌室的設計和建設應符合GB 50364和GB 19489的相關(guān)要求。
1.1.2 無(wú)菌室大小應能夠滿(mǎn)足檢驗工作的需要，內墻為淺色，地面和地面應光滑，墻壁與地面、天花板連接處應呈凹弧形，無(wú)縫隙，無(wú)死角，易于清潔和消毒。
1.1.3 無(wú)菌室入口處應設置緩沖間，緩沖間內應安裝非手動(dòng)式開(kāi)關(guān)的洗手盆，并可有毛巾。緩沖間應有足夠的面積以保證操作人員更換工作服及鞋帽。
1.1.4 無(wú)菌室內工作臺的高度約80cm,工作臺應保持水平，工作臺二應無(wú)滲漏，耐腐蝕，易于清潔、消毒。
1.1.5 無(wú)菌室內光照應分布均勻，工作臺面的光照度應不低于540Ix。
1.1.6 無(wú)菌室應具備適當的通風(fēng)和溫度調節的條件。無(wú)菌室的推薦溫度為20℃，相對濕度為40%~60%。
1.1.7 緩沖間及操作室內均應設置能達到空氣消毒效果的紫外燈或其他適宜的消毒裝置。
1.2.1 無(wú)菌室在使用前和使用后應進(jìn)行有效的消毒。
1.2.2 無(wú)菌室的滅菌效果應至少每?jì)芍茯炞C一次。
1.2.3 應制定清潔、消毒、滅菌、使用和應急處理程序。
1.2.4 應記錄環(huán)境檢測結果，并歸檔保存。
1.2.5 不符合規定時(shí)應立即停止使用
1.3.1 無(wú)菌室
1.3.1.1 紫外線(xiàn)消毒
（1）在室溫20C~ 25℃時(shí)，220V30W紫外燈下方垂直位置1.0m處的253.7nm紫外線(xiàn)輻射強度應70W/cm2,低于此值時(shí)應更換，適當數量的紫外燈，確保平均每立方米應不少于1.5W。
（2）紫外線(xiàn)消毒時(shí)，無(wú)菌室內應保持清潔干燥。
（3）在無(wú)人條件下，可采取紫外線(xiàn)消毒，作用時(shí)間應30min,室內濕度20%或40%、相對濕度大于60%時(shí)，應適當延長(cháng)照射時(shí)間。
（4）用紫外線(xiàn)消毒物品表面時(shí)，應使照射表面受到紫外線(xiàn)的直接照射，且應達到足夠的照射劑量。
（5）人員在關(guān)閉紫外燈至少30min后方可入內作業(yè)。
（6）按照GB 15981的規定，評價(jià)紫外線(xiàn)的消毒與殺菌效果。
1.3.1.2 臭氧消毒
（1）封閉無(wú)菌室內，無(wú)人條件下，采用20mg/m3濃度的臭氧,作用時(shí)間應30min。消毒后室內臭氧濃度0.2mg/m3時(shí)方可入內作業(yè)。
（2）按照GB/T 18202的規定，檢測室內臭氧的濃度。
1.3.1.3 無(wú)菌室空氣滅菌效果驗證方法(沉降法)
（1）在消毒處理后與開(kāi)展檢驗活動(dòng)之前期間采樣。
（2）取樣點(diǎn)的選擇應基于人員流量情況和做試驗的頻率。一般情況下，無(wú)菌室面積30m2時(shí)，從所設定的條對角線(xiàn)選取3點(diǎn)，即中心1點(diǎn)，兩端各距離墻1m處各取1點(diǎn)；無(wú)菌室面積30m2時(shí)，選取東西北中5點(diǎn)，其中東點(diǎn)、南點(diǎn)、西點(diǎn)、北點(diǎn)均距離墻lm.
1.3.2 生產(chǎn)環(huán)境衛生指標:
裝配與包裝車(chē)間空氣中細菌菌落總數應≤2500CFU/m3
工作臺表面細菌菌落總數應≤20CFU/cm2
工人手表面細菌菌落總數應≤300CFU/只手，并不得檢出致病菌。
食品生產(chǎn)線(xiàn)每?jì)尚r(shí)取樣1次，異常停機時(shí)再取一次。每天取樣12瓶，然后在12瓶中隨機抽取3瓶做微生物檢測。
做微生物之前，在緩沖間用75%的酒精對樣品外表進(jìn)行殺菌。之后送到傳遞窗口處。避免樣品對無(wú)菌間造成二次污染。
2.1 工作臺面與工人手表面采樣與測試方法
2.1.1樣品采集
工作臺:將經(jīng)滅菌的內徑為5cm*5cm的滅菌規格板放在被檢物體表面，用以浸有滅菌生理鹽水的棉簽在其內涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。
工人手:被檢人五指并攏，用以浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來(lái)回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。
2.1.2 細菌菌落總數檢測
將已采集的樣品在6h內送實(shí)驗室，每支采樣管充分混勻后取1mL樣液，放入滅菌平皿內，傾注營(yíng)養瓊脂培養基，每個(gè)樣品平行接種兩個(gè)平皿，置35℃土2℃培養48h,計數平板上細菌菌落數。
2.2 空氣采樣與測試方法
2.2.1 樣品采集
在動(dòng)態(tài)下進(jìn)行。
室內面積不超過(guò)30m3，在對角線(xiàn)上設里中外三點(diǎn):里、外點(diǎn)位置距墻1m;室內面積超過(guò)30m3,設東西南北中5點(diǎn)，周?chē)?點(diǎn)距墻1m。采樣時(shí)，將含營(yíng)養瓊脂培養基的平板(真徑9cm)置采樣點(diǎn)(約桌面高度)，打開(kāi)平皿蓋，使平板在空氣中暴露5min。
2.2.2 細菌培養
在采樣前將準備好的營(yíng)養瓊脂培養基置35℃土2℃培養24h,取出檢查有無(wú)污染，將污染培養基剔除。
將已采集的培養基在6h內送實(shí)驗室，于35℃土2℃培養48h,觀(guān)察結果，計數平板上細菌菌落數。
三、培養基與試劑制備的制備和殺菌
3.1.1 無(wú)菌生理鹽水的配制
用精確到0.01g的電子稱(chēng)稱(chēng)取8.5g微生物檢測專(zhuān)用鹽，在100mL燒杯中用二次凈化水溶解后，轉移到1000mL的無(wú)色透明的容量瓶并用二次凈化水定容到1000mL備用。
3.1.2 營(yíng)養瓊脂培養基的配制
稱(chēng)取35g營(yíng)養瓊脂培養基用二次凈化水在250mL的燒杯中溶解后，轉移到1000mL的無(wú)色透明的容量瓶并用二次凈化水定容到1000mL。然后用250mL的錐形瓶分裝備用。
3.2.1 生理鹽水的分裝
將配置好的生理鹽水用500mL的量筒按照每個(gè)錐形瓶裝225mL的量進(jìn)行分裝。分裝好用乳膠錐形瓶塞塞好錐形瓶，并用牛皮紙將瓶口包扎好。
3.2.2 營(yíng)養瓊脂的分裝
將配置好的營(yíng)養瓊脂用500mL的錐形瓶裝進(jìn)行分裝。分裝好用乳膠錐形瓶塞塞好錐形瓶，并用牛皮紙將瓶口包扎好。
3.2.3 孟加拉紅瓊脂的分裝
將配置好的營(yíng)養瓊脂用500mL的錐形瓶裝進(jìn)行分裝。分裝好用乳膠錐形瓶塞塞好錐形瓶，并用牛皮紙將瓶口包扎好。
3.2.4 乳糖膽鹽肉湯的分裝
將配置好的乳糖膽鹽用10mL的量管分裝在玻璃試管中，試管規格為15*150mm,錐形瓶裝進(jìn)行分裝。分裝好用乳膠錐形瓶塞塞好錐形瓶，并用牛皮紙將瓶口包扎好。
3.3.1 培養基通常應采用高壓濕熱滅菌法，121℃滅菌15min,特殊培養基按使用者的特殊要求進(jìn)行滅菌(如含糖培養基，115℃滅菌20min。)
3.3.2 部分培養基(如嗜鹽瓊脂培養基，膽硫乳培養基等)，只能煮沸滅菌。
3.3.3 對熱敏感的培養基或添加物質(zhì)，應采用膜過(guò)濾方法進(jìn)行過(guò)濾除菌。
3.3.4 即用型試劑不需滅菌，應參見(jiàn)相關(guān)國際標準或供應商使用說(shuō)明，直接使用。
3.4.1 生理鹽水的殺菌
將分裝完畢的生理鹽水，放在殺菌釜內，擺放好。然后關(guān)上殺菌釜， 打開(kāi)電源，升溫到80℃時(shí)，打開(kāi)放氣閥進(jìn)行放氣，帶放氣閥門(mén)噴出大量水蒸氣時(shí)關(guān)上放氣閥。升溫至121℃開(kāi)始計時(shí)，殺菌30min停止加熱，進(jìn)行自然冷卻，待壓力回歸零時(shí)，打開(kāi)放氣閥門(mén)進(jìn)行放氣。等待條菌釜內氣壓全部排凈完后打開(kāi)殺菌釜，將生理鹽水取出送往微生物操作間的小窗內。
3.4.2 營(yíng)養瓊脂的殺菌
將分裝完畢的營(yíng)養瓊脂，放在殺菌釜內，擺放好。然后關(guān)上殺菌釜，打開(kāi)電源，升溫到80℃時(shí)，打開(kāi)放氣閥進(jìn)行放氣，帶放氣閥門(mén)噴出大量水蒸氣時(shí)關(guān)上放氣閥。升溫至121℃開(kāi)始計時(shí)，殺菌30min停止加熱，進(jìn)行自然冷卻，待壓力回歸零時(shí)，打開(kāi)放氣閥門(mén)門(mén)進(jìn)行放氣。等待殺菌釜內氣壓全部排凈完后打開(kāi)殺菌釜，將生理鹽水取出送往微生物操作間預處理間的水浴鍋，進(jìn)行保溫，水浴鍋的溫度46土1℃.
3.5.1 孟加拉紅瓊脂培養基的配制
稱(chēng)取36g營(yíng)養瓊脂用二次凈化水在250mL的燒杯中溶解后，轉移到1000mL的無(wú)色透明的容量瓶并用二次凈化水定容到1000mL。然后用250mL的錐形瓶分裝備用。
3.5.2 乳糖膽鹽肉湯的配制
稱(chēng)取36g營(yíng)養瓊脂用二次凈化水在250mL的燒杯中溶解后，轉移到1000mL的無(wú)色透明的容量瓶并用二次凈化水定容到1000mL。然后用250mL的錐形瓶分裝備用。
3.6.1 孟加拉紅瓊脂的殺菌
將分裝完畢的營(yíng)養瓊脂，放在殺菌釜內，擺放好。然后關(guān)上殺菌釜，打開(kāi)電源,升溫到80℃時(shí)，打開(kāi)放氣閥進(jìn)行放氣，帶放氣閥門(mén)噴出大量水蒸氣時(shí)關(guān)上放氣閥。升溫至121℃開(kāi)始計時(shí)，殺菌30min停止加熱，進(jìn)行自然冷卻，待壓力回歸零時(shí)，打開(kāi)放氣閥門(mén)進(jìn)行放氣。等待殺菌釜內氣壓全部排凈完后打開(kāi)殺菌釜，將生理鹽水取出送往微生物操作間預處理間的水浴鍋，進(jìn)行保溫，水浴鍋的溫度46℃士1℃。
3.6.2 乳糖膽鹽肉湯的殺菌
將分裝完畢的乳糖膽鹽發(fā)酵管，放在殺菌釜內，擺放好。然后關(guān)上殺菌金，打開(kāi)電源，升溫到80℃時(shí)，打開(kāi)放氣閥進(jìn)行放氣，帶放氣閥門(mén)噴出大量水蒸氣時(shí)關(guān)上放氣閥。升溫至121℃開(kāi)始計時(shí)，殺菌30min停止加熱，進(jìn)行自然冷卻，待壓力回歸零時(shí)，打開(kāi)放氣閥門(mén)進(jìn)行放氣。等待殺菌釜內氣壓全部排凈完后打開(kāi)殺菌釜，將生理鹽水取出送往微生物操作間的小窗內。
培養皿將培養基處理完，用84消毒液浸泡30min后，用洗潔精清洗干凈后用干燥箱烘干(160℃、30min)后，用牛皮包扎好，在160℃干熱殺菌2小時(shí)。1mL的吸量管也用84消毒液浸泡30min后，用洗潔精清洗干凈后用干燥箱烘干(160℃、30min)后，用牛皮紙包扎好，在160℃干熱殺菌2小時(shí)。
3.8.1 濕熱滅菌:采用高壓滅菌器，121℃滅菌20min,適用于玻璃器皿、移液器吸頭、塑料瓶等按照GB 15981的規定，評價(jià)高壓滅菌器的殺菌效果。
3.8.2 干熱滅菌:采用干燥箱滅菌，160℃滅菌2h,180℃滅菌1h，適用于玻璃器皿，不銹鋼器具等。
3.8.3 液體消毒劑消毒:使用適當濃度的自配或商業(yè)液體消毒劑對工作臺面、器具或設備表面進(jìn)行消毒?？砂凑誈B 15981的規定，評價(jià)自配或商業(yè)消毒劑的消毒效果;可按照ISO 18593,監測工作臺面、器具或設備表面的消毒效果。
基過(guò)熱或添加濃度錯誤。
四、微生物實(shí)驗操作
4.1.1 無(wú)菌操作臺和微生物操作間殺菌消毒。
每次做實(shí)驗之前，用75%的酒精對無(wú)菌操作臺和微生物操作間進(jìn)行噴灑消毒，然后開(kāi)啟無(wú)菌操作臺上面的紫外燈對無(wú)菌操作臺殺菌30min以上。同時(shí)，開(kāi)啟微生物操作間紫外燈對空氣殺菌消毒30min以上。
4.1.2 微生物檢驗人員的工作服、帽、口罩和鞋子的殺菌。微生物檢驗人員的工作服、帽、口罩和鞋子在實(shí)驗之前，在微生物操作緩沖間用紫外燈殺菌30min以上。操作人員在進(jìn)入微生物操作間時(shí)，先用香皂清洗手，然后用消毒好的毛巾擦干手，再用75%的酒精對手進(jìn)行噴灑殺菌。
4.1.3 營(yíng)養瓊脂和孟加拉紅培養基外表面的殺菌。
營(yíng)養瓊脂培養基在拿進(jìn)微生物操作間時(shí)，先用75%的酒精噴酒消毒，因為錐形瓶外表面容易長(cháng)菌，同時(shí)在打開(kāi)錐形瓶塞是用酒精燈對瓶塞外表烤邊進(jìn)行殺菌。微生物操作時(shí)，倒平板時(shí)，培養皿應該靠近酒精燈，同時(shí)每次對錐形瓶口烤下。
4.1.4 乳糖膽鹽發(fā)酵口和樣品的口殺菌。
五、實(shí)驗室廢棄物處理
5.1 對于培養物及其污染的物品(如斜面，用過(guò)的吸量管、細菌培養皿等)，應使用適當濃度的自配或商業(yè)液體消毒劑(參照D.1)對處理后一定時(shí)間，或121℃高壓滅菌至少30min,或者其他有效處理措施。將處理物倒入特殊標識的垃圾袋內，直接送到指定地
點(diǎn)。
5.2 對于實(shí)驗動(dòng)物尸體及相關(guān)廢棄物，按照GB 14925的規定進(jìn)行處理。
5.3 記錄并保留廢棄物和處理的記錄。
六、實(shí)驗結果報告
6.1 菌落總數的計數
可用肉眼觀(guān)察，必要時(shí)用放大鏡，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。
選取南落數在30CF∪到300CFU之間、無(wú)基延菌落生長(cháng)的平板計數菌落總數，低于30CFU平板記錄具體菌落數，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個(gè)稀釋度的菌落數應采用兩個(gè)平板的平均數。
其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(cháng)時(shí)，則不宜采用，而應以無(wú)片狀菌落生長(cháng)的平板作為該稀釋度的菌落數:若狀菌落不到平板的一半，而其余一半菌落分布又很均勻，即可計算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數。
6.2 菌落總數的計算方法
若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個(gè)平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g(mL)樣品中菌落總數的結果。
若有兩個(gè)連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內，按公式計算。
若所有稀釋度的平板上菌落數大于300CFU,則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。
若所有稀釋度的平板上菌落數小于30CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(cháng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。
若所有稀釋度的平板上菌落數均不在30CFU300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU,則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
6.3 菌落總數的報告
菌落數小于100CFU時(shí)，按照“四舍五入”原則修約，以整數報告。
菌落數大于或等于100CFU時(shí)，第3位數字采用“四舍五入”原則修約:取前2位數字，后面用0代替位數:也可用10的指數形式來(lái)表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數字。
若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計數，則報告菌落蔓延。
若空白對照上有菌落生長(cháng)，則此次檢測結果無(wú)效。
6.4 霉菌和醇母菌計數
可用肉眼觀(guān)察，必要時(shí)用放大鏡，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。
選取菌落數在10CFU到150CFU的平板、根據菌落形態(tài)分別計數霉菌和醉母數。霉菌蔓延生長(cháng)覆蓋整個(gè)平板的可記錄為多不可數。菌落數應采用兩個(gè)平板的平均數。
6.5 霉菌和醇母菌菌落總數的計算方法
計算兩個(gè)平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋信數計算。
若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300CFU則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。
若所有稀釋度的平板上菌落數小于10CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
若所有稀釋度(包括液休樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(cháng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算:如為原液，則以小于1計數。
6.6 霉菌和酵母菌菌落總數的報告
菌落數在100以?xún)葧r(shí)，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數字報告。
菌落數大于或等于100CFU時(shí)，第3位數字采用“四舍五入”原則修約:取前2位數字，后面用0代替位數也可用10的指數形式來(lái)表示，按“四舍五入”原則可。采用兩位有效數字。
七、設備的校準、維護和性能驗證
7.1 總則
7.1.1 設備操作要求
實(shí)驗室負責人應確保每位操作人員均能按照說(shuō)明書(shū)或設備操作指導書(shū)的要求進(jìn)行操作。
7.1.2 設備手冊
所有設備檔案應按照易于檢索的方式存檔。包括設備手冊，使用說(shuō)明書(shū)、維修保養指南:購買(mǎi)時(shí)所附帶的全部技術(shù)資料以及采購、驗收的記錄。還應該搜集設備使用記錄、維修保養記錄等。
7.1.3 設備記錄
7.1.3.1 應詳細記錄與預期質(zhì)量控制結果不一致的情況，附上所采取的糾正措施，由負責分析的人員驗證并通知實(shí)驗室負責人。實(shí)驗室負責人應定期審核這些記錄。
7.1.3.2 每臺對檢測質(zhì)量有影響的設備應有使用記錄本并放在設備附近。
7.1.3.3 有關(guān)設備的每個(gè)事件都應記錄在案，包括日期、事件、采取的糾正措施、登記人的姓名等。
7.1.3.4 應保存所有設備最近三年的使用記錄本和維護記錄本。
7.2 設備的校準
應根據需要、設備類(lèi)型和以往的性能情況和相應的法規要求確定校準頻率(見(jiàn)表C.1)
7.2.1 設備校準要求和頻率
7.2.2 設備性能驗證要求和頻率
7.2.3 設備維護、清潔的要求和頻率
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