實(shí)驗一 人類(lèi)體細胞染色體標本制備與核型分析
Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype
【實(shí)驗目的】
1． 熟悉人類(lèi)外周血淋巴細胞的培養方法及染色體標本的制備方法。
2． 熟悉人類(lèi)染色體G顯帶標本制備與分析。
【實(shí)驗原理】
染色體是在顯微鏡下可見(jiàn)細胞有絲分裂過(guò)程中出現的結構。因此，必須獲得染色體標本才能進(jìn)行檢查分析，通常情況下，都是利用外周血淋巴細胞進(jìn)行核型分析。正常情況下，人體外周血淋巴細胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴細胞轉化成淋巴母細胞，使其恢復增殖能力。因此，可采取少量外周靜脈血，做短期培養，培養至72小時(shí)細胞進(jìn)入增殖旺盛期，此時(shí)加入秋水仙素抑制細胞分裂，使細胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細胞，經(jīng)低滲、固定、制片、染色后鏡下觀(guān)察進(jìn)行核型分析。上述制備的染色體標本經(jīng)胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色體縱軸上顯示出著(zhù)色深、淺相間的橫紋——帶，表明每條染色體的特征。
【實(shí)驗用品】
1．采血器材、酒精燈、培養瓶、超凈工作臺、恒溫培養箱、恒溫水浴箱、離心機、刻度離心管、乳頭吸管、試管架、量筒、試劑瓶、載玻片、吹風(fēng)機、托盤(pán)天平、顯微鏡、鏡油、二甲苯、擦鏡紙、鑷子、燒杯、記號筆、玻片架、火柴、10ml注射器。
2．RPMI 1640液體培養基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）、KCl低滲液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸緩沖液（PH6.8）。
3．2.5％胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4％酚紅、Giemsa染色液、1N鹽酸、1N氫氧化鈉。
【實(shí)驗步驟】
一．外周血淋巴細胞染色體標本制備與分析
1. 采血及接種培養
1.1 在酒精燈火焰上，用滅菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素濕潤至管壁。
1.2 常規消毒后，采集外周靜脈血5ml，轉動(dòng)注射器使血液與肝素混勻。
1.3 在超凈工作臺中，預先將RPMI 1640液體培養基（5ml，含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清）加入消毒好的小培養瓶中，再滴加25滴全血（6號針頭），水平搖動(dòng)混勻。
1.4 置37℃恒溫培養箱中培養72小時(shí)。培養過(guò)程中每天水平搖動(dòng)培養物1～2次，使血液均勻懸浮，再繼續培養。
1.5 終止培養前2～4小時(shí)，加入秋水仙素，使終濃度達到0.2μg/ml。輕輕搖動(dòng)培養瓶，使秋水仙素混勻。繼續培養至72小時(shí)。
2．制片
2.1 收集細胞時(shí)，去掉瓶塞，用乳頭吸管吸取培養液，充分混勻培養物，再將全部培養物吸入刻度離心管中。
2.2 1000 rpm離心8分鐘（注意先配平）。
2.3 棄上清液，加入37℃預溫的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml，用吸管輕輕吹打細胞團混勻后，置37℃恒溫水浴箱低滲處理25分鐘。
2.4 加入 1ml新配制的固定劑（甲醇：冰乙酸=3：1），用吸管小心吹打、混勻，1000rpm離心8分鐘。
2.5 棄上清液，加入8ml固定劑，吹打細胞團制成細胞懸液后，室溫下固定20分鐘。
2.6 1000 rpm離心 8分鐘。
2.7 棄上清液，重復固定一次。
2.8 棄上清液，根據細胞數量的多少適當加入數滴新配制的固定劑，吹打細胞制成懸液。
2.9 吸取少量細胞懸液，滴2～3滴于冰水浸泡過(guò)的載玻片上，吹散，氣干。
2.10 將標本置Giemsa染液中，染色8分鐘，水洗去浮色，氣干。
2.11 顯微鏡下觀(guān)察染色體標本分裂相的多少及分散情況。
二．人外周血淋巴細胞染色體G顯帶標本制備與分析
1. G顯帶染色體標本制備
1.1 常規制片后，將標本置70℃烤箱中干烤2小時(shí)，自然冷卻。
1.2 取2.5％胰酶溶液5ml，加入染色缸中，加入45 ml生理鹽水，用 1N HCl或1N NaOH及酚紅調節胰酶溶液成紫紅色（PH6.8～7.2），置 37OC預溫。
1.3 將玻片標本放入胰酶溶液中處理25～45秒鐘，不斷輕輕搖動(dòng)玻片，使胰酶作用均勻。隨著(zhù)處理標本數量增加，胰酶逐漸消耗，胰酶作用時(shí)間逐漸延長(cháng)。
1.4 取出染色體玻片標本，置于37℃預溫的生理鹽水中，然后用蒸餾水沖洗玻片（或輕甩，除去多余的胰酶）。
1.5 將玻片標本放入37℃預溫的Giemsa染液中，染色5～10分鐘。
1.6 自來(lái)水沖洗，氣干。
1.7 顯微鏡觀(guān)察。
【實(shí)驗結果與分析】
一. 常規染色體核型分析
1．根據染色體的形態(tài)、大小及著(zhù)絲粒的位置，將染色體分為七組。
A組染色體：包括1～3號染色體。長(cháng)度最長(cháng)，1號和3號染色體為中央著(zhù)絲粒，2號染色體為亞中央著(zhù)絲粒染色體。
B組染色體：包括4～5號染色體，長(cháng)度次于A(yíng)組；亞中央著(zhù)絲粒染色體，短臂較短。
C組染色體：包括6～12號和X染色體，中等長(cháng)度，亞中央著(zhù)絲粒染色體。
D組染色體：包括13～15號染色體，具有近端著(zhù)絲粒和隨體。
E組染色體：包括16～18號染色體，16號染色體著(zhù)絲粒在 3/8處，17號和 18號染色體著(zhù)絲粒約在 1/4處。
F組染色體：包括19號和20號染色體，中央著(zhù)絲粒。
G組染色體：包括21號、22號和Y染色體，是染色體組中最小的，為近端著(zhù)絲粒的染色體。21號和22號染色體具有隨體。
2．繪圖：繪出在顯微鏡下觀(guān)察到的染色體。
二．G顯帶染色體標本分析
G帶顯示的正常人顯帶核型特征（見(jiàn)附圖1.1、1.2、1.3）
A組染色體：包括1～3號染色體。長(cháng)度最長(cháng)，1號和3號染色體為中央著(zhù)絲粒，2號染色體為亞中央著(zhù)絲粒染色體。
1號染色體
短臂：在320條帶左右的分裂相上，近側段有兩條深帶，第2條深帶稍寬；在處理好的標本上，遠側段可顯出34條淺染的深帶。此臂分為3個(gè)區，近側的第1深帶為2區1帶，第2深帶為3區1帶。
長(cháng)臂：副縊痕緊貼著(zhù)絲粒，染色深淺不一，其遠側為一寬的淺帶，近中段與遠側段各有兩條深帶，中段兩條深帶稍靠近，其中第2條染色較濃。此臂分為四個(gè)區，副縊痕遠側的淺帶為2區1帶，中段第2深帶為3區1帶，遠側段第1深帶為4區1帶。
2號染色體
短臂可見(jiàn)四條深帶，中段的兩條深帶較靠近。此臂分為2個(gè)區，中段兩條深帶之間的淺帶為2區 1帶。
長(cháng)臂：有 7條深帶，第 3和第4深帶有時(shí)融合。此臂分為 3個(gè)區．第2和第3深帶之間的淺帶為2區1帶，第4和第5深帶之間的淺帶為3區1帶。
3號染色體
著(zhù)絲粒區濃染
短臂：在近側段可見(jiàn)一條較寬的深帶，遠側段可見(jiàn)兩條深帶，其中遠側的一條較窄，且著(zhù)色較淺，這是區別3號染色體短臂的重要特征。近側段的深帶可分為兩條深帶。此臂分2個(gè)區，中段淺帶為2區1帶。
長(cháng)臂：一般在近側和遠側段各有一條較寬的深帶。在顯帶好的標本上，近側段的深帶可分為兩條深帶，遠側段的深帶可分為三條深帶。此臂分為2個(gè)區，中段淺帶為2區1帶。
B組染色體：包括4～5號染色體，長(cháng)度次于A(yíng)組；亞中央著(zhù)絲粒染色體，短臂較短。
4號染色體
短臂：可見(jiàn)兩條深帶，近側深帶染色較淺，短臂只有一個(gè)區。
長(cháng)臂：可見(jiàn)均勻分布的四條深帶，在顯帶較好的標本上，遠側段的兩條深帶可各自再分為兩條較寬的深帶。此臂分為3個(gè)區，近側段第1和第2深帶之間的淺帶為2區1帶，遠側段的兩條深帶之間的淺帶為3區1帶。
5號染色體
短臂：可見(jiàn)兩條深帶，其中遠側的深帶寬而且色濃，短臂只有一個(gè)區。
長(cháng)臂：近側段有兩條深帶，染色較淺，有時(shí)不明顯；中段可見(jiàn)三條深帶，染色較深，有時(shí)融合成一條寬的深帶；遠側段可見(jiàn)二條深帶，近末端的一條著(zhù)色較濃。此臂可分為3個(gè)區，中段第 2深帶為 2區1帶，中段深帶與遠側段深帶之間的寬闊的淺帶為 3區 1帶。
C組染色體：包括6～12號和X染色體，中等長(cháng)度，亞中央著(zhù)絲粒染色體。
6號染色體
短臂：中段有一條明顯而寬闊的淺帶，其中近側段和遠側段各有一條深帶，近側深帶緊貼著(zhù)絲粒；在顯帶較好的標本上，遠側段的深帶又可分為兩條深帶。此臂分為2個(gè)區，中段的明顯而寬闊的淺帶為2區1帶。
長(cháng)臂：可見(jiàn)五條深帶，其中近側的一條緊貼著(zhù)絲粒，遠側段末端的一條深帶著(zhù)色較淺。此臂分為2個(gè)區，第2和第3深帶之間的淺帶為2區1帶。
7號染色體
著(zhù)絲粒濃染。
短臂：有三條深帶，中段深帶著(zhù)色較淡，有時(shí)不明顯；遠側深帶著(zhù)色濃寬，狀如”瓶蓋”。此臂分為2個(gè)區，遠側段的淺帶為2區1帶。
長(cháng)臂：有三條明顯的深帶，遠側近末端的一條深帶著(zhù)色較淡，第2和第3深帶稍接近。此臂分為3個(gè)區，近側第1深帶為2區二帶，中段的第2深帶為3區1帶。
8號染色體
短臂：有兩條深帶，中段有一條較明顯的淺帶，這是與10號染色體相區分的主要特征。此臂分為2個(gè)區，中段的淺帶為2區1帶。
長(cháng)臂：可見(jiàn)三條分界不明顯的深帶，遠側段的深帶著(zhù)色較濃。此臂分為2個(gè)區，中段的深帶為2區1帶。
9號染色體
著(zhù)絲粒濃染。
短臂：近側段和中段各有一條帶，在顯帶較好的標本上，中段可見(jiàn)兩條窄的深帶，此臂分為2個(gè)區，中段的深帶為2區1帶。
長(cháng)臂：可見(jiàn)明顯的兩條深帶，副縊痕一般不著(zhù)色，在有些標本上顯現出特有狹長(cháng)的頸部區。此臂分為 3個(gè)區，近側的一條深帶為2區 1帶，遠出的一條深帶為3區二帶。
10號染色體
著(zhù)絲粒濃染。
短臂：近出段和中段各有一條深帶，在有些標本的中段可見(jiàn)兩條深帶，但與8號染色體短行比較，其深帶的分界不夠清晰。此臀只有一個(gè)區。
長(cháng)臂：可見(jiàn)明顯的三條帶，近側的深帶較明顯，遠側的兩條深帶較靠近，這是與8號染色體相鑒別的主要特征。此管分為2個(gè)區，近側段的一條深帶為2區1帶。
11號染色體
短臂：近中段可見(jiàn)兩條靠的很近的較窄的深帶．在顯帶較差的標本上，只能看見(jiàn)一條寬帶。此臂只有1個(gè)區。
長(cháng)臂：近側有一條深帶，緊貼著(zhù)絲粒．遠側段可見(jiàn)一條明顯的較寬的深帶，這條深帶與近側的深帶之間是一條寬闊的淺帶，這是與12號染色體相鑒別的一個(gè)明顯特征；在顯帶較好的標本上，遠側段的深帶可分為兩條較窄的深帶，兩深帶之間有一條很窄的淺帶，一般極難辨認，但它是一個(gè)分區的界標，在有些標本上近末端處還可見(jiàn)一條窄的淡色的深帶。此臂分為2個(gè)區，上述遠側兩條深帶之間的淺帶為2區1帶。
12號染色體
短臂：中段可見(jiàn)一條深帶。此臂只有1個(gè)區。
長(cháng)臂：近側有一條深帶，緊貼著(zhù)絲粒；中段有一條寬的深帶，這條深帶與近側深帶之間有一條明顯的淺帶，但與11號染色體相比較這條淺帶較窄，這是鑒別11號與12號染色體的一個(gè)主要特征；在顯帶好的標本上，中段較寬的深帶可分為三條深帶，其正中的一條著(zhù)色較濃；在有些標本上，遠側段的近端還可見(jiàn)1～2條染色較淡的深帶。此行分為2個(gè)區，中段正中的深帶為2區1帶。
X染色體
其長(cháng)度介于7號和8號染色體之間。
短臂：中段有一條明顯的深帶，如竹節狀。在有些標本上，遠側段還可見(jiàn)一條窄的、著(zhù)色淡的深帶。此臂分為2個(gè)區，中段的深帶為2區1帶。
長(cháng)臂：可見(jiàn)4～5條深帶，近中部的一條深帶最明顯。此臂分為2個(gè)區，近中段的深帶2區1帶。
D組染色體：包括13～15號染色體，具有近端著(zhù)絲粒和隨體。
13號染色體
著(zhù)絲粒濃染。
長(cháng)臂：可見(jiàn)4條深帶，第1和第4帶較窄，染色較淡。第2和第3深帶較寬，染色較濃，此臂分為3個(gè)區，第2深帶為2區1帶，第3深帶為3區1帶。
14號染色體
著(zhù)絲粒濃染。
長(cháng)臂：近側和遠側各有一條明顯的深帶，在處理好的標本上，中段尚可見(jiàn)一條較淺的深帶。此臂分為3個(gè)區，近側深帶為2區1帶，遠側深帶為3區1帶。
15號染色體
著(zhù)絲粒濃染。
長(cháng)臂：中段有一條明顯的深帶，染色較濃，有的標本上，近側段可見(jiàn)l～2條淡染的深帶。此臂分為2個(gè)區，中段深帶為2區1帶。
E組染色體：包括 16～18號染色體，16號染色體著(zhù)絲粒在 3/8處，17號和 18號染色體著(zhù)絲粒約在 1/4處。
16號染色體
短臂：中段有一條深帶，較好的標本上可見(jiàn)兩條深帶。此臂只有1個(gè)區。
長(cháng)臂：中段和遠側各有一條深帶，有時(shí)遠側段的一條不明顯，副縊痕著(zhù)色濃。此臂分為2個(gè)區，中段深帶為2區1帶。
17號染色體
短臂：有一條深帶，緊貼著(zhù)絲粒。此臂只有1個(gè)區。
長(cháng)臂：遠側段可見(jiàn)一條深帶，這條帶與著(zhù)絲粒之間為一明顯而寬的淺帶。此臂分為2個(gè)區，這條明顯而寬的淺帶為2區1帶。
18號染色體
短臂：有一條窄的深帶。此臂只有1個(gè)區。
長(cháng)臂：近側和遠側各有一條明顯的深帶。此臂分為2個(gè)區，兩深帶之間的淺帶為2區1帶。
F組染色體：包括19號和20號染色體，中央著(zhù)絲粒。
19號染色體
著(zhù)絲粒及周?chē)鸀樯顜?，其余為淺帶。短臂和長(cháng)臂均只有1個(gè)區。
20號染色體
著(zhù)絲粒區濃染。
短臂：有一條明顯的深帶。此臂只有1個(gè)區。
長(cháng)臂：在中段和遠側段可見(jiàn)1—2條染色較淺的深帶，有時(shí)全為淺帶。此管只有1個(gè)區。
G組染色體：包括21號、22號和Y染色體，是染色體組中最小的，具近端著(zhù)絲粒的染色體。21號和22號染色體具有隨體。
21號染色體
著(zhù)絲粒區著(zhù)色淺。
與22號染色體相比較，其長(cháng)度比22號短。其長(cháng)臂近側有一明顯而寬的深帶。此臂分為2個(gè)區，其深帶為2區1帶。
22號染色體
著(zhù)絲粒區染色濃。
與21號染色體相比較，其長(cháng)度比21號長(cháng)；在長(cháng)臂上可見(jiàn)兩條深帶，近側的一條著(zhù)色較濃而且緊貼著(zhù)絲粒，近中段的一條著(zhù)色淺，在有的標本上不顯現。此臂只有1個(gè)區。
Y染色體
長(cháng)度變化較大，有時(shí)整個(gè)長(cháng)臂被染色成深帶。在染色較好的標本上，可見(jiàn)兩條深帶。此臂只有1個(gè)區。
圖1.1 G顯帶染色體核型
圖1.2 G顯帶染色體核型分析
圖1.3 正常男性G顯帶染色體模式圖
【注意的問(wèn)題】
1．采血時(shí)不要加入太多的肝素，因為肝素含量過(guò)多時(shí)往往抑制淋巴細胞的轉化。
2．培養過(guò)程中培養液逐漸變黃色，說(shuō)明pH發(fā)生了較大變化，將不利于細胞生長(cháng)，此時(shí)可加入適量滅菌的1.4% NaHCO3溶液調整，或再加入2～3ml培養液的辦法來(lái)校正。
3．培養失敗的原因，一般有下述幾種：①培養瓶及器材洗滌不符合要求；②配制溶液的雙蒸水不符合要求；③PHA和培養液的質(zhì)量有問(wèn)題，或培養液pH不符合要求；④無(wú)菌操作不符合要求，發(fā)生污染；⑤淋巴細胞對PHA反應降低，致分裂相太少。
4．標本質(zhì)量不佳的原因：①秋水仙素的處理不當，如秋水仙素的濃度不夠或處理時(shí)間不足，結果分裂相太少；如濃度過(guò)高或處理時(shí)間過(guò)長(cháng)，則使染色體過(guò)于縮短，難于進(jìn)行分析；②低滲處理不當，低滲處理時(shí)間過(guò)長(cháng)時(shí)，細胞膜往往過(guò)早破裂，染色體丟失；如果低滲處理不夠，則染色體分散不佳，難以進(jìn)行計數分析；③離心速度不合適，收集細胞時(shí)離心的速度太低易丟失細胞，如果低滲后離心速度過(guò)高，往往使分裂相過(guò)早破裂，完整的分裂相減少；④標本固定不充分，如固定液不新鮮，或甲醇、冰醋酸的質(zhì)量不佳，結果染色體模糊，或殘留胞漿痕跡，使背景不清；⑤玻片去污不徹底，冷凍不夠，使細胞懸液不能均勻附著(zhù)以致細胞大量丟失，或染色體分散不佳。
5．制備G顯帶染色體標本時(shí)，要嚴格控制胰酶消化時(shí)間，時(shí)間不足顯不出帶紋，時(shí)間過(guò)長(cháng)，使染色體不規則或形成空泡狀。
附 錄
一、試劑及配制：
1、RPMI1640培養液
RPMI1640 10.4g
肝素 80mg
PHA 182mg
胎牛血清 100ml
抗菌素 8萬(wàn)單位
NaHCO3 2g
雙蒸水定容至1000ml。
抽濾除菌，分裝，-200C保存待用。
2、低滲液（0.075Mol KCl）
KCl 2.794 g
三蒸水 500ml
3、固定液
甲醇（AR）：冰醋酸（AR）=3：1 現用現配。
4、Giemsa染液
貯存液
Giemsa 5g
純甘油（AR） 330ml
甲醇 （AR） 33ml
先將Giemsa粉劑溶于少量的甘油中，在研缽中充分研磨至無(wú)顆粒粘糊狀，再將全部甘油加入，然后移至燒杯中，在55～60OC溫箱中放置2小時(shí)，冷卻后加入甲醇，充分攪拌均勻，在室溫放置2～3周后過(guò)濾除去絮狀物，儲存在棕色瓶中，一般放置3周后使用效果更好。
使用液
磷酸緩沖液甲、乙各2.5ml，加45ml雙蒸水，加Giemsa原液2.5ml。
5、2.5%胰蛋白酶原液
胰蛋白酶粉劑 2.5g
生理鹽水 100ml
6、秋水仙素（10mg/ml，使用液100μg/ml）
秋水仙素 1g
生理鹽水 100ml 抽濾，4OC棕色瓶保存。
7、肝素（2500U/ml，使用濃度50U/ml）
肝素鈉 312.5 mg
生理鹽水 100ml 高壓滅菌。
8、Hanks液（g/L）
NaCl 8.00
KCl 0.40
CaCl2 0.14
MgSO4•7H2O 0.20
Na2HPO4 0.06
KH2PO4 0.06
NaHCO3 0.35
葡萄糖 1.00
酚紅 0.02
二、記錄和檢查回報表
表1 染色體病病例檢查分析記錄
送檢材料： 檢查目的： 送檢時(shí)間：
編 號： 送 檢 者： 院 科 醫生
患者姓名： 性 別： 年 齡：
臨床檢查摘要于臨床初步診斷：
家系資料：
表2 染色體檢查記錄
（記錄內容：顯微鏡號、標本號、座標、核型與異常特點(diǎn)）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
37
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
48
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
表3 染色體畸變分析記錄
玻片號
性別號
座 標
核 型
畸變染色體特點(diǎn)
照片編號
討 論：
分析結果： 分析者：
年 月 日
表4 核型分析
1 2 3 4 5
A B
6 7 8 9 10 11 12 X
C
13 14 15 16 17 18
D E
19 20 21 22 Y
F G
表5核型分析檢查回報單
姓 名
性 別
年 齡
送檢材料
送檢目的
時(shí) 間
編 號
送檢者
院 科 醫生
臨 床 初
步 診 斷
細 胞 遺
傳 學(xué) 檢
查 結 果
（1）X染色質(zhì)檢查 Y染色質(zhì)檢查
（2）核型分析
（3）皮膚文理特征
（4）家系分析
診 斷
檢查者 簽字
年 月 日
實(shí)驗二 X和Y染色質(zhì)標本的制作與觀(guān)察
X and Y Chromatin Preparation and Observation
【實(shí)驗目的】
熟悉X染色質(zhì)和Y染色質(zhì)的形態(tài)特征及其檢查方法
【實(shí)驗原理】
正常女性核型為46，XX。在間期細胞核中緊貼核膜內緣有一個(gè)染色較深的橢圓形小體，即X染色質(zhì)，這是女性細胞中一條X染色體隨機Lyon化失活形成的。這種失活保證了雌雄兩性細胞中都只有一條有活性的染色體，使兩性X連鎖基因產(chǎn)物的量保持在相同水平上。稱(chēng)為X染色體的劑量補償（參考Lyon假說(shuō)）。
正常男性核型為46，XY。在男性間期細胞核中，可見(jiàn)位于細胞核邊緣或核中央處有一極小的黃色熒光亮點(diǎn)，就是Y染色質(zhì)（Y小體），大小約0.25～0.3μm。是Y染色體長(cháng)臂特異性著(zhù)色而形成。
人的性別是由X和Y染色體決定的。需要對人的性別進(jìn)行鑒定時(shí)，除進(jìn)行染色體核型分析和臨床生殖器官的檢查外，還可以通過(guò)細胞學(xué)方法，如檢查期間體細胞（口腔上皮，皮膚，羊水和血細胞等）的核內染色質(zhì)——X和Y染色質(zhì)來(lái)鑒定。
【實(shí)驗用品】
顯微鏡、熒光顯微鏡、乙醇(無(wú)水乙醇,95％,70％、50％)，甲醇，冰醋酸，硫堇，1％結晶紫，1mol/L HCl。二甲苯、香柏油、擦鏡紙、蓋玻片、載片、15ml刻度離心管、牙簽、吸水紙、小鑷子、碘酒、酒精棉球、采血針、3％醋酸溶液、pH6～6.5緩沖液、0.5％鹽酸阿的平染液。
（注：硫堇染液(工作液)，①干液(硫堇)：硫堇1g或2g溶于100mL 50%乙醇中，溶解后過(guò)濾備用；②醋酸鈉緩沖液：醋酸鈉·3H2O 9.7g，巴比妥鈉14.7g，溶于500mL蒸餾水中；③0.1 mol／L鹽酸；按①：②：③=40：28：32比例配成混合液，調pH5.7±0.2，即得硫堇工作液。）
【實(shí)驗步驟】
一、X染色質(zhì)的制備和觀(guān)察
（一）取材
1. 讓受檢者用水漱洗口腔數次，以盡量除去口腔內細菌或其它雜物。
2. 用牙簽鈍頭部或木質(zhì)器具刮取口內側面的口腔粘膜上皮，棄去第一次刮到的細胞。
3. 同一部位連續刮取數次，將刮取物涮入裝有生理鹽水的離心管內。
（二）標本的制作
1. 將細胞懸液的離心管進(jìn)行離心（1 500 rpm）10分鐘，去上清液，留下細胞團。
2. 加入新配制的固定液（3份甲醇︰1份冰醋酸）8mL，混勻呈懸液。固定30分鐘。
3. 離心（同上），去上清液，留下細胞團。
4. 加入數滴（根據細胞多少而增減）固定液，充分混勻呈懸液。
5. 滴一滴懸液至預先置冰盒中的干凈載玻片上，晾干。每份樣本制片3—4張。
（三）染色
Klinger硫堇染色法
1. 將玻片標本置入1mol/L HCl中，37℃條件下水解20分鐘。
2. 用蒸餾水充分沖洗、晾干。
3. 硫堇染液中染色約15分鐘。
4. 蒸餾水沖洗、晾干。
硫堇染色的優(yōu)點(diǎn)是只有細胞核清晰著(zhù)色，胞漿不著(zhù)色，因此細胞核背景清晰，利于對位于核膜邊緣的X染色質(zhì)的辨認。
結晶紫的染色法
1. 固定后的玻片標本經(jīng)過(guò)70％、50％酒精及蒸餾水（更換兩次蒸餾水）各5分鐘。
2. 置入1％結晶紫溶液中染色5～8分鐘。大量制片時(shí)可用0.5％結晶紫染液，染色10～15分鐘左右。
3. 95％酒精中分化（快速地在酒精中沾5～8次）。
4. 繼續在無(wú)水乙醇中分化，間歇地用顯微鏡檢查，直至標本中核結構的微細部分都很清楚為止（一般約1分鐘）。
5. 置入二甲苯中。更換2次二甲苯，每次3分鐘，以使標本透明。
6. 樹(shù)膠封片。
（四）觀(guān)察
1.先在低倍鏡(10倍鏡)下觀(guān)察，可見(jiàn)視野中有許多單個(gè)或成堆的口腔上皮細胞。選擇清楚而分散的細胞，移至視野中央，再換高倍鏡仔細觀(guān)察?？谇簧掀ぜ毎麨槎噙呅蔚谋馄綘?，細胞中央有一被染成深蘭色的圓形或橢圓形的細胞核。核周?chē)|(zhì)部分為細胞質(zhì)。細胞的外表為一很難與細胞質(zhì)相區別的薄膜即細胞膜。
2. 40倍或油鏡下檢查100個(gè)“可計數細胞”，并計數具有X染色質(zhì)的細胞數。
二、Y染色質(zhì)的制片與觀(guān)察
（一）制作標本
1. 采血與涂片：男同學(xué)用碘酒，酒精棉球常規消毒食指或耳垂后，用采血針點(diǎn)刺食指或尖或耳垂，擠出2～3滴血于一干凈的底玻片中央，用牙簽將血滴涂成較厚的一層血膜，直徑約1.5cm，晾干。
2. 固定：加3％的醋酸溶液數滴于血膜上，靜置15分鐘，其間可換液一次，使紅細胞溶解。
3. 用pH6～6.5磷酸緩沖液沖洗血膜，晾干。
4. 染色：加0.5％鹽酸阿的平溶液數滴于血膜上，放置暗處靜置染色15分鐘。（若使用口服阿的平片劑，則用100mg溶于10ml雙蒸水中，染色時(shí)間為25分鐘）。
5. 再用磷酸緩沖液沖洗黃色溶液。
6. 加蓋玻片，在有緩沖液的情況下，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察。
（二）觀(guān)察Y染色質(zhì)
先在低倍鏡下觀(guān)察，可見(jiàn)許多白細胞（多為淋巴細胞）核染成黃色。換高倍鏡，可見(jiàn)位于細胞核邊緣或核中央處有一極小的黃色熒光亮點(diǎn)，就是Y染色質(zhì)（Y小體），大小約0.25～0.3μm。最后可用油鏡再仔細觀(guān)察。Y染色質(zhì)在男性白細胞的出現率可達60～70％。注意需要計數的細胞必須是核膜完整無(wú)缺，核質(zhì)染色均勻，清晰可見(jiàn)，核周?chē)鸁o(wú)細菌和其它污染物質(zhì)的干擾。
【實(shí)驗結果與分析】
觀(guān)察并計算X染色質(zhì)的陽(yáng)性率。X染色質(zhì)的標準是：
1. 位于核膜內緣。
2. 核內唯一的濃染、輪廓清楚的小體，直徑約為1～1.5μm,一般呈平凸形、圓形、扁平形或三角形。
(注：配制的pH6～6.5的磷酸緩沖液要用黑紙或茶色瓶置于冰箱保存，有效期一個(gè)月。)
實(shí)驗三 姊妹染色單體交換實(shí)驗
Sister Chromosome Exchange （SCE）
【實(shí)驗目的】
熟悉制備SCE標本的原理和基本程序。
【實(shí)驗原理】
姊妹染色單體交換（Sister chromatial exchange,SCE）是染色體同源座位上復制產(chǎn)物間的相互交換，是同一染色體的兩條單體之間發(fā)生的一類(lèi)特殊的同源重組，主要在DNA合成期形成，可能與DNA雙鏈的斷裂與復制有關(guān)，SCE的發(fā)生的頻率可反映細胞在S期的受損程度。如果一個(gè)個(gè)體的SCE率明顯增高，可表明染色體受到環(huán)境中的一定因素的影響，或是受到遺傳缺陷的內在制約因素所致。
在細胞分裂時(shí)，每條染色體均有兩條染色單體組成，每條染色單體有一條雙鏈DNA組成。5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxy- uridine，BrdU）是脫氧胸腺嘧啶核苷的類(lèi)似物，在DNA鏈的復制過(guò)程中，可替代胸腺嘧啶。當細胞生存環(huán)境中存在BrdU時(shí)，BrdU取代脫氧胸苷摻入到復制的DNA中。經(jīng)兩個(gè)復制周期后，兩條姊妹染色單體中一條DNA的雙鏈均有BrdU摻入，而另一條DNA雙鏈中僅有一條鏈有BrdU摻入。利用特殊的分化染色技術(shù)對染色體標本進(jìn)行處理，可使雙鏈均含有BrdU摻入的單體淺染，而只有一條鏈摻入BrdU的單體深染。當姊妹染色體間存在同源片段交換時(shí)，可根據每條單體夾雜著(zhù)深淺不一的著(zhù)色片段加以區分。由于姐妹染色單體的DNA序列相同，SCE并不改變遺傳物質(zhì)組成，但SCE是由于染色體發(fā)生斷裂和重接而產(chǎn)生的，因此，SCE顯示方法通常用來(lái)檢測染色體斷裂頻率，用來(lái)研究藥物和環(huán)境因素的致畸效應。
【實(shí)驗用品】
1. 超凈工作臺、恒溫培養箱、恒溫水浴箱、冰箱、離心機、顯微鏡、采血器材、酒精燈、培養瓶、刻度離心管、膠塞、乳頭吸管、試管架、載玻片、托盤(pán)天平、干燥烤箱、染色缸、電吹風(fēng)、30W紫外燈。
2. 試劑：RPMI 1640培養液、小牛血清、秋水仙素（100μg/mL）、5-溴尿嘧啶（BrdU，200μg/mL）、低滲液（0.075 mol/L KCL溶液）、2×SSC、Giemsa原液、甲醇、冰乙酸。
【實(shí)驗步驟】
1. 按半微量法采取外周靜脈血，接種培養。
2. 37℃培養24小時(shí)后，加BrdU溶液（終濃度為8μg/mL）混勻。
3. 用黑紙包裹培養瓶，繼續培養48小時(shí)。
4. 收獲前加入秋水仙素（終濃度為0.2μg/mL），繼續培養1小時(shí)。
5. 常規法制片。將玻片標本室溫放置2～3天。
6. 分化染色前一天，將標本置37℃過(guò)夜。
7. 在平皿中平行放置兩根牙簽，將玻片放在牙簽上，加適量2×SSC溶液（以不超過(guò)標本為度）。在標本上蓋一張比玻片稍大的擦鏡紙，使紙邊浸入2×SSC溶液中，并使2×SSC溶液滲至玻片標本上，保持標本濕潤。
8. 將平皿置55℃水浴面上，用30W紫外燈垂直照射標本30分鐘，照射距離10cm。
9. 照射后輕輕取掉擦鏡紙，立即用蒸餾水沖洗標本。
10. Giemsa染色5～10分鐘；蒸餾水沖洗標本，氣干。
11. 鏡檢，計數。
每個(gè)末端交換記為1次SCE，中部交換記為2次SCE。
【實(shí)驗結果與分析】
觀(guān)察30個(gè)細胞的分裂相，記錄每個(gè)細胞的SCE總數，計算SCE頻率。
n個(gè)中期分裂相SCE之和
SCE頻率=
n個(gè)細胞
中國人正常SCE頻率為5.7±0.4。
實(shí)驗四 銀染核仁形成區與近端著(zhù)絲粒染色體隨體聯(lián)合
AgNO3 Staining NOR and Satellite Association of Acrocentric Chromosome
【實(shí)驗目的】
熟悉銀染的原理和方法。
【實(shí)驗原理】
人類(lèi)近端著(zhù)絲粒染色體的副縊痕與核仁形成有關(guān)，故稱(chēng)為核仁形成區（NOR）。當位于此處的18S、28S核糖體RNA的基因（rDNA）具有轉錄活性時(shí)，應用銀染技術(shù)可使NOR特異性著(zhù)色（褐黑色）。進(jìn)一步證明銀染物質(zhì)不是rDNA，亦不是rRNA，可能是核仁形成區特異的蛋白質(zhì)，即和rRNA轉錄相聯(lián)系的酸性蛋白。人類(lèi)核糖體RNA基因位于5對近端著(zhù)絲點(diǎn)染色體短臂的次猛痕處，即人類(lèi)的核仁形成區。在正常人中， 不是所有核仁形成區均被銀染，其范圍大約4-10。應用銀染法可以覺(jué)察正常人體核糖體RNA基因的活動(dòng)。此外，人類(lèi)近端著(zhù)絲粒染色體的隨體間易發(fā)生聯(lián)合，應用銀染技術(shù)可在發(fā)生聯(lián)合的染色體間清楚地看到銀染物質(zhì)相連。因此，應用銀染核仁形成區（Ag-NOR）與近端著(zhù)絲粒染色體隨體聯(lián)合（Ag-AA）技術(shù)，可以分析有活性的rRNA基因的動(dòng)態(tài)變化。正常人Ag-NOR平均為5.8/細胞。
【實(shí)驗用品】
1. 恒溫水浴箱、顯微鏡、平皿、牙簽、擦鏡紙、鑷子；
2. 預制染色體玻片標本、0.1％甲酸、AgNO3（50％）。1：20 Giemsa,5mol/L HCl。
【實(shí)驗步驟】
1. 按半微量法采取外周靜脈血，接種培養。常規法制片。將染色體玻片標本在室溫下放置2～3天。
2. 將標本置入5mol/L HCl溶液中常溫處理5分鐘，蒸餾水沖洗2-3次，甩干。
3． 將500mg AgNO3溶于1 ml 0.1％甲酸溶液中，混勻后立即滴4～5（5ml）滴至玻片標本上。
4. 在平皿中平行放置兩根牙簽，將玻片標本放在牙簽上。
5. 在標本上蓋一張比玻片稍小的擦鏡紙，用鑷子掀動(dòng)紙片數次，使染液均勻分散在標本上。
6. 將平皿置于60℃水浴箱中處理3-5分鐘，直至擦鏡紙呈棕黃色終止反應。
7. 蒸餾水沖洗去擦鏡紙，以1：20 Giemsa染液復染3分鐘。水洗，氣干。
8. 鏡下觀(guān)察。
【實(shí)驗結果與分析】
1. Ag-NOR的計數：選擇銀染著(zhù)色清晰的分裂相，計數6個(gè)D組（13、14、和15號染色體）和4個(gè)G組（21和22號染色體）近端著(zhù)絲粒染色體，不論單側或雙側的銀染點(diǎn)都計數為一個(gè)有銀染的染色體。
2. Ag-AA計數：凡近端著(zhù)絲粒染色體之間有銀染物質(zhì)相連的，均計數為Ag-AA。涉及2條近端著(zhù)絲粒染色體的聯(lián)合，記為1個(gè)Ag-AA；涉及3條近端著(zhù)絲粒染色體的聯(lián)合，如未形成閉環(huán)的，記為2個(gè)Ag-AA；3條染色體聯(lián)合形成閉環(huán)時(shí)，記為3個(gè)Ag-AA；依此類(lèi)推。
N個(gè)核型中含NOR染色體數之和
NOR均值=
N個(gè)核型
（注：避免AgNO3 溶液污染皮膚，否則將其染成褐黑色，很難洗掉。）
實(shí)驗五 核酸提取
The Extraction of Nucleic Acid
【實(shí)驗目的】
1．掌握核酸提取的基本原理和基本方法
2．掌握檢測核酸濃度及純度的原理及方法
【實(shí)驗原理】
DNA是遺傳信息的載體,是最重要的生物信息分子,是分子生物學(xué)研究的主要對象,因此DNA的提取也應是分子生物學(xué)實(shí)驗技術(shù)中最重要、最基本的操作。如不能有效的完成DNA提取方面的工作，那就根本談不上進(jìn)行分子生物學(xué)方面的實(shí)驗。在DNA提取過(guò)程中應做到：1、根據不同研究需要，保證結構的相應完整性；2、盡量排除其它大分子成分的污染(蛋白質(zhì)、多糖及RNA等)；3、保證提取樣品中不含對酶有抑制作用的有機溶劑及高濃度的金屬離子。
核酸的提取關(guān)鍵是去除蛋白質(zhì)，通常情況下，先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白質(zhì)后，再用有機溶劑抽提，在單價(jià)陽(yáng)離子存在下，核酸在乙醇中形成沉淀。
作DNA或RNA定量時(shí)，應在260nm和280nm兩個(gè)波長(cháng)下讀數。在260nm的讀數用于計算樣品中的核酸濃度，OD值為1相當于大約50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA及大約20μg/ml單鏈寡核苷酸。根據在260nm以及在280nm的讀數比值估計核酸的純度。DNA及RNA純品的OD260/OD280值分別是1.8和2.0，如果樣品中污染有蛋白或酚，其OD260/OD280將明顯低于此值，此時(shí)無(wú)法對樣品中的核酸進(jìn)行精確定量。
【實(shí)驗用品】
1．臺式離心機；電熱恒溫水浴箱；冰箱；紫外分光光度計；一次性塑料手套。
2．微量加樣器（1000μl,200μl，20μl）；Tip頭（1000μl,200μl，20μl）。Tip頭盒（1000μl,200μl，20μl）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。
3．DNA提取的相關(guān)試劑：
1）蛋白酶K（10mg/ml）,-20℃保存。
2）TE（pH 8.0）:10mmol/L Tris.Cl（pH 8.0）,1mmol/L EDTA（pH 8.0）, 15磅高壓滅菌后室溫保存。
3）10% SDS：10g SDS溶于90ml 水中，加熱68℃助溶，加幾滴濃鹽酸調節pH至7.2，加蒸餾水定容至100ml，室溫保存。
4）3M NaAc: 800ml水中溶解408.1g三水乙酸鈉，用冰乙酸調節pH值至5.2，加水定容至1L，高壓滅菌，室溫保存。
5）飽和氯化鈉，70%乙醇，氯仿
6）飽和酚
【實(shí)驗步驟】
飽和氯化鈉抽提法提取外周血DNA
1．取0.5ml抗凝全血，加入0.8ml TE(pH 8.0)混勻；
2．室溫離心，10000rpm ，1分鐘；
3．棄上清，加入0.4ml TE(pH 8.0)，混勻，懸浮細胞；
4．加入10mg/ml蛋白酶K 5μl（終濃度100μg/ml）,10% SDS 25μl(終濃度0.5%)，混勻；
5．37℃水浴消化過(guò)夜，或50℃消化4小時(shí)；
6．加入1/3體積的飽和氯化鈉，充分混勻，4℃靜置10分鐘；
7．10000rpm離心10分鐘，取上清于另一新管中；
8．加入等體積氯仿，混勻，10000rpm離心10分鐘；
9．取上清于另一新管中，加入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2)混勻；
10．加入2倍體積無(wú)水乙醇輕輕混合，10000rpm離心1分鐘；
11．棄上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗滌；
12．10000rpm離心1分鐘，棄上清，自然干燥DNA約5分鐘；
13．加入200-250μl TE，-20℃保存；
14．檢測濃度及純度。
酚氯仿抽提法提取外周血DNA
1．外周血反復凍溶破壞紅細胞，取0.5ml外周血，加入0.5ml PBS混勻后，10000rpm 離心10分鐘；
2．棄上清，加入180μl TE(pH 8.0)，20μl 10% SDS, 10mg/ml蛋白酶K 5μl（終濃度100μg/ml）混勻；
3．37℃水浴消化過(guò)夜，或50℃消化4小時(shí)；
4．加入等體積的飽和酚并充分混勻，10000rpm離心10分鐘；
5．吸取上清液于另一新管中，重復上一步驟一次；
6．吸取上清液于另一新管中，加入等體積的酚氯仿并充分混勻，10000rpm離心10分鐘；
7．吸取上清液于另一新管中，加入1/20體積的3M NaAc(pH 5.2) 混勻后，加入2倍體積無(wú)水乙醇并輕輕混合，可見(jiàn)絮狀乳白色DNA團塊，10000rpm離心10分鐘；
8．棄上清，加入70%乙醇0.5ml，充分洗滌；
9. 10000rpm離心1分鐘，棄上清，自然涼干后加入TE液，-20℃保存；
10．檢測濃度及純度
組織總RNA的提取
1. 將組織用錫箔紙包裹后于液氮中凍10min，擊碎后回收入2ml無(wú)菌Eppendorff管中。按50-100mg組織樣品加1ml TRIZOL試劑進(jìn)行組織勻漿,樣品體積不應超過(guò)TRIZOL試劑體積的10%；
2.將組織勻漿液在15-30℃放置5min,促使核蛋白復合物完全解離,按1ml TRIZOL,加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15s,15-30℃放置2-3min,在2-8℃,離心轉速不超過(guò)12000g,離心15min,將上清液轉入新的離心管中(上清液約占TRIZOL試劑體積的60%)；
3. 在上清液中按1mlTRIZOL試劑(最初勻漿體積)加入0.5ml異丙醇混勻,15-30℃放置10min,在2-8℃,離心轉速不超過(guò)12000g,離心10min；
4. 棄上清,70%乙醇洗滌RNA沉淀 (1ml TRIZOL試劑至少加入1ml 70%乙醇),振蕩混勻,在2-8℃,離心轉速不超過(guò)7500g,離心5min；
5. 室溫或真空干燥RNA沉淀,重新溶于DEPC水中(55℃-60℃溫浴10min).
6. 紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度；
7. 1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分離總RNA，每孔上樣25μg，65V，2.5h，以檢測RNA的質(zhì)量。
【實(shí)驗結果分析】
1. 計算已提取的DNA的濃度和純度
【思考題】
1．DNA提取還有哪些方法？
2．RNA提取中關(guān)鍵問(wèn)題是什么？
實(shí)驗六 DNA重組技術(shù)
Recombinant DNA
【實(shí)驗目的】
1．掌握DNA重組技術(shù)的基本原理和基本方法
2．熟悉質(zhì)粒DNA的小量制備及酶切鑒定方法
【實(shí)驗原理】
1．DNA重組技術(shù)
重組DNA(Recombinant DNA)技術(shù)是遺傳工程的核心技術(shù)，也是人類(lèi)在基因和DNA分子水平進(jìn)行操作的技術(shù)。它包括以下幾個(gè)步驟：
1）重組DNA分子的構建：即將目的基因（DNA或cDNA片段）與載體DNA重組，應用TA克隆方法,將PCR擴增產(chǎn)物快速克隆至質(zhì)粒載體中。該方法利用了PCR過(guò)程中使用的熱穩定聚合酶(Taq酶)在所復制的雙鏈分子末端加上單一脫氧腺苷酸(A),從而產(chǎn)生一A-粘性末端的性質(zhì),設計一種線(xiàn)性載體,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR產(chǎn)物,在DNA連接酶作用下，目的DNA和載體DNA連接形成重組DNA分子。
2）將重組DNA分子轉化宿主細胞。
3）克隆選擇增殖：將轉化后的液體涂布于瓊脂培養基表面，培養基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應抗生素的抗性基因，轉化的細菌能在培養基上生長(cháng)形成集落。挑取菌落，置液體培養基中培養，得到大量含重組DNA的細菌。
4）收獲擴增后的培養細胞，提取重組DNA分子（質(zhì)粒），并純化，獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。
圖2.1 TA克隆原理示意圖
圖2.2 克隆選擇增殖原理示意圖
2．質(zhì)粒DNA的小量制備
常見(jiàn)的質(zhì)粒DNA提取方法有簡(jiǎn)易一步提取法、堿裂解法和煮沸法。本實(shí)驗采用的是堿裂解法，堿裂解法的原理：在PH 12.0~12.6堿性環(huán)境中，線(xiàn)性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒（CC）DNA仍為自然狀態(tài)。將pH調至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結構。大部分染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心，將可去除大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收質(zhì)粒DNA。
3．質(zhì)粒DNA的限制性?xún)惹泻怂崦福ㄏ拗泼福┣蟹治?div style="height:15px;">
限制酶存在于原核生物體內，根據其結構和功能特性分為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切點(diǎn)不固定，Ⅲ型其切割位點(diǎn)在識別位點(diǎn)之外，只有Ⅱ型其特異性切點(diǎn)位置可以控制和預測，可以產(chǎn)生固定的DNA片段，基因工程中所用的限制酶均為Ⅱ型限制酶。這類(lèi)酶的特點(diǎn)是具有能夠識別雙鏈DNA分子上的特異性核苷酸序列的能力，能在這個(gè)特異性核苷酸序列內切斷DNA雙鏈，形成一定長(cháng)度和順序的DNA片段。選擇合適的限制酶對重組的環(huán)狀質(zhì)粒進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用已知相對分子量的線(xiàn)狀DNA（DNA分子量標志）及未經(jīng)酶切的重組環(huán)狀質(zhì)粒為對照，可以對重組環(huán)狀質(zhì)粒中的目的DNA分子進(jìn)行初步鑒定。
1．PCR擴增儀；恒溫振蕩培養箱；超凈工作臺；細菌恒溫培養箱；臺式高速離心機；電熱恒溫水浴箱；冰箱；電泳儀； 電泳槽，樣品槽模板（梳子）；紫外燈；保鮮膜；一次性塑料手套；凝膠自動(dòng)成像儀。
3．微量加樣器（1000μl,200μl，20μl）；Tip頭（1000μl,200μl，20μl）。Tip頭盒（1000μl,200μl，20μl）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。Parafilm，透明膠帶。
1）Taq DNA聚合酶，緩沖液，dNTP，特異性引物，靶DNA；凝膠回收試劑盒；TA克隆載體：pMD18-T；感受態(tài)細菌；氨芐青霉素（100mg/ml）。
溶液Ⅰ(10×)：0.5M葡萄糖；0.25M Tris-Cl (pH8.0)；0.1M EDTA，10磅高壓消毒，4℃保存備用.
